Produção Nacional
Revisado por pares
AVALIAÇÃO POR IMUNOHISTOQUÍMICA DE PECAM-1 E VE-CADERINA EM CÉLULAS ENDOTELIAIS MEDULARES EM UM MODELO DE CARÊNCIA PROTEICA
2015; Frederico Kauffmann Barbosa; Volume: 12; Issue: 28 Linguagem: Português
ISSN
1807-8850
AutoresVaniky Duarte Marques, Edgar Matias Bach Hi,
Tópico(s)Hematopoietic Stem Cell Transplantation
ResumoA desnutricao proteica e proteico-energetica (DPE) e o tipo mais frequente de desnutricao, estimando-se que mais de 30% da humanidade sofre de algum grau de desnutricao. (GADDUCCI, et al., 2001; AKNER & CEDERHOLM, 2001; NOVA, et al., 2002; KEUSCH, 2003).Sua causa primaria e uma reducao na ingestao de alimentos ou da utilizacao inapropriada de energia e proteina (LATHAM, 1990). Fisiologicamente, em seres humanos apos o nascimento, a hematopoese ocorre exclusivamente na medula ossea. A producao de celulas sanguineas em um padrao constante depende do microambiente medular, estrutura organizada que regula a fisiologia da celula tronco hematopoetica (CTH) (LAKSHMIPATHY & VERFAILLIE, 2005). Assim que as CTH caem na corrente circulatoria elas se aninham em locais distantes chamados nichos hematopoeticos, onde a disposicao anatomica vascular e os elementos celulares de sustentacao formam um microambiente ideal para o seu desenvolvimento e assim para a hematopoese (LORENZI, 2006). Na Medula ossea adulta existem dois tipos de nichos que envolvem a localizacao da CTH: o vascular e o osteoblastico. A maioria das CTHs estao localizadas perto do endotelio com preferencia pela regiao do endosteo em direcao a uma area altamente vascularizada ao centro da Medula Ossea, ou seja, o nicho vascular. Ele promove a proliferacao, diferenciacao e migracao das CTH. Aproximadamente 60% das CTH ficam em volta dos vasos sanguineos da Medula Ossea, sugerindo assim que a vascularizacao e um quesito essencial para que a CTH desempenhe seu papel. Isso nos leva a sugerir que esse e o principal nicho hematopoetico em condicoes fisiologicas e que a maioria das CTH e perivascular (ANTHONY; LINK, 2013; EHNINGER; TRUMPP, 2011; GAVIRO et. al., 2012). Esse nicho e composto por celulas endoteliais, progenitores mesenquimais perivasculares, macrofagos e expressao de CXCL12 em celulas estromais (incluindo CAR, leptina + e nestina GFP+) (ANTHONY; LINK, 2013; FERRER et. al., 2010). As celulas endoteliais estao associadas fortemente com as celulas hematopoeticas, ja que recobrem os vasos sanguineos que suplementam as CTH, ou seja, fazem parte do nicho perivascular. Elas formam o endotelio e promovem a autorrenovacao, diferenciacao e contribuem para a manutencao da CTH atraves da producao de SCF (Fator de celula tronco). Portanto, quando esse nicho perivascular,nicho osteoblastico e/ou seus componentes estao alterados a hematopoese sera alterada, pois o tecido hematopoetico, como os tecidos que possuem uma alta taxa de renovacao celular, requerem uma ampla fonte de nutrientes, e podem assim serem alterados em estados nutricionais deficientes (Borelli, et al., 2007; Xavier, et al., 2007; ANTHONY;LINK, 2013; GAVIRO et. al., 2012). Em estados de desnutricao proteica energetica altera-se o fornecimento de nutrientes para o nicho medular e o nicho perivascular. Tendo como resultado uma hematopoese e granulopoese comprometidas (principalmente a eritropoese) ocorrendo uma reducao na meia vida dos eritrocitos e consequente anemia (CUNHA et al., 2013; BORELLI et al., 2007). A desnutricao proteica compromete a hematopoese e afeta o microambiente medular, assim avaliar as alteracoes no nicho perivascular ocasionada por esta enfermidade pode fornecer informacoes importantes a respeito da manutencao da quiescencia, auto-renovacao e diferenciacao da celula-tronco hematopoetica. Visto que o microambiente e uma estrutura altamente organizada, o objetivo sera avaliar a influencia da desnutricao proteica sobre a expressao de marcadores vasculares no microambiente medular a partir da expressao das proteinas marcadoras de celulas endoteliais medulares PECAM-1 e VE-CADERINA (atraves de anti PECAM-1 e anti VE-CADERINA) pela tecnica de imunohistoquimica. Para essa avaliacao foram utilizados camundongos (Mus musculus domesticus) machos, com 45-60 dias de idade, da linhagem C57BL/6 (isogenica) provenientes de colonias mantidas pelo Bioterio de Producao e Experimentacao da Faculdade de Ciencias Farmaceuticas e do Instituto de Quimica da Universidade de Sao Paulo. Apos o desmame, os animais receberam racao Purina® (Nestle, Sao Paulo, Brasil) e agua ad libitum ate atingirem a idade estipulada para inicio dos experimentos. Foram utilizados dois tipos de racao – normoproteica e hipoproteica - para a alimentacao dos animais neste modelo experimental. O projeto foi aprovado pelo Comite de Etica em Experimentacao Animal da Faculdade de Ciencias Farmaceuticas da Universidade de Sao Paulo. Os animais foram entao previamente pesados e separados em gaioleiros metabolicos. Inicialmente os animais passaram por um periodo de adaptacao (10 a 15 dias) e ao final desse periodo os animais foram divididos em dois grupos: Controle e Desnutrido. No periodo de inducao da desnutricao, os animais do grupo Controle receberam racao normoproteica, contendo 12% de proteina, e os animais do grupo Desnutrido receberam racao hipoproteica, contendo 2% de proteina. As racoes utilizadas sao isocaloricas (3601,0 kcal/kg), diferindo apenas na concentracao proteica que e definida pela quantidade de caseina adicionada. ( REEVES et al., 1993 ). O periodo para a inducao a desnutricao utilizado foi de 35 a 40 dias, sendo que o peso e o consumo de racao de cada animal foram avaliados a cada 48 horas ( FOCK et al., 2010 ). Os animais de ambos os grupos foram sacrificados para a retirada dos esternos, que foram fixados em paraformaldeido 4% por 24hs, sob agitacao para posterior descalcificacao. Os blocos foram incluidos em parafina e seccionados em 5µm, seguindo-se o processo de Imunohistoquimica com os anticorpos primarios (anti- PECAM-1 ou anti-VE-CADERINA, ImmunoCruz™ rabbit ABC Staining System: sc-2018). As amostras foram coradas com hematoxilina de Mayers e Eosina e montadas em Entellan para posterior avaliacao em microscopio de luz. Controles negativos foram incluidos em todos os experimentos e foram obtidos pela omissao do anticorpo na etapa de incubacao com anticorpo primario. Os resultados obtidos foram analisados utilizando o programa GraphPad Prism 6.0eO for Mac OS X (GraphPad Software Inc., San Diego, EUA). Dessa forma foram feitos comparacoes estatisticas parametricas realizadas por test-T onde a probabilidade aceita como indicativa da existencia de diferencas estatisticamente significativas foi de p < 0,05. A analise imunohistoquimica para PECAM-1 e VE-CADERINA representou a media do numero de vasos da medula ossea de camundongos do grupo Controle (n=4) e do grupo Desnutrido (n=4) onde n representa o numero de animais avaliados. Os resultados demonstram maior marcacao no grupo Desnutrido, dessa forma apresentando maior contagem de vasos na medula ossea.
Referência(s)