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Reversion of molecularly engineered, partially attenuated, very virulent infectious bursal disease virus during infection of commercial chickens

2004; Taylor & Francis; Volume: 33; Issue: 2 Linguagem: Francês

10.1080/03079450310001652112

1465-3338

R. Raue, MR Islam, Md. Nazrul Islam, Koushikul Islam, S.C. Badhy ., P. M. Das, H. Müller,

Animal Virus Infections Studies

A molecularly cloned, tissue culture-adapted infectious bursal disease virus (BD-3tc) was generated from a very virulent strain by the reverse genetics approach following site-directed mutagenesis (Q253H and A284T in VP2). The pathogenicity of BD-3tc was tested in commercial chickens. The wild-type strain (BD-3wt) and the molecularly cloned parental strain (BD-3mc) were included for comparison. The subclinical course of the disease, with delayed and milder pathological lesions followed by quick follicular regeneration in the bursa of Fabricius in BD-3tc-inoculated birds, suggested that these amino acid substitutions made BD-3tc partially attenuated. However, severe bursa atrophy was observed at 14 days after inoculation. Reverse transcription-polymerase chain reaction coupled with restriction enzyme analysis revealed that both point mutations in BD-3tc had reverted 14 days after inoculation. Further investigations demonstrated that the codon for amino acid at position 284 had already reverted to the wild-type phenotype (T284A) 3 days after inoculation. Résumé Réversion d'un virus de la bursite infectieuse, très virulent mais atténué partiellement par génie moléculaire, chez des poulets de chair durant l'infection Un virus de la bursite infectieuse aviaire (BD-3tc) adapté à la culture cellulaire et cloné moléculairement a été généré à partir d'une souche très virulente par une approche de génétique reverse suivant une mutagenèse dirigée (Q253H et A284T de VP2). La pathogénicité du virus BD-3tc a été étudiée chez des poulets de chair. La souche sauvage BD-3wt et la souche parentale clonée moléculairement (BD-3mc) ont été étudiées en comparaison. Chez les animaux inoculés avec la souche BD-3tc, l'évolution subclinique de la maladie, avec des lésions pathologiques moins sévères, plus tardives et qui ont été suivies par une régénération folliculaire rapide dans la bourse de Fabricius laisse supposer que les substitutions de ces acides aminés rendent la souche BD-3tc partiellement atténuée. Cependant, une atrophie sévère de la bourse a été observée 14 jours après inoculation. Une RT-PCR couplée à l'analyse d'une restriction enzymatique a révélé que les deux points de mutation de la souche BD-3tc ont reversé 14 jours après inoculation. Des investigations complémentaires ont démontré que le codon pour l'acide aminé en position 284 avait déjà reversé au phénotype sauvage (T284A) trois jours après inoculation. Zusammenfassung Reversion eines gentechnisch hergestellten, teilweise attenuierten hochvirulenten Stammes des Virus der infektiösen Bursitis nach der Infektion nicht-spezifiziert pathogen freier Hühner Unter Verwendung reverser Genetik wurde aus einem hochvirulenten Stamm des Virus der infektiösen Bursitis ein Zellkultur-adaptierter Stamm (BD-3tc) hergestellt, in dem mittels gerichteter Mutagenese die Aminosäuren Q253H und A284T in VP2 ausgetauscht worden sind. Die Pathogenität von BD-3tc wurde in nicht-spezifiziert pathogen freien Hühnern getestet. Der Wildtyp-Stamm (BD-3wt) und der gentechnisch hergestellte Elternstamm (BD-3mc) wurden in die Untersuchungen einbezogen. Der subklinische Verlauf der Krankheit mit verzögert einsetzenden und milderen pathologischen Veränderungen der Bursa Fabricii, gefolgt von einer schnellen Follikel-Regeneration in den BD-3tc-infizierten Hühnern, ließen vermuten, dass der Austausch der genannten Aminosäuren zu einer teilweisen Attenuierung des Stammes BD-3tc geführt hatte. Jedoch wurde 14 Tage nach der Inokulation eine schwere Atrophie der Bursa beobachtet. Untersuchungen mittels RT-PCR und nachfolgenden Restriktionsenzymanalysen ergaben, dass beide Punktmutationen in BD-3tc revertiert waren. Weitere Untersuchungen zeigten, dass die Reversion für das Codon der Aminosäure an Position 284 zum Phenotyp des Wildtyps (T284A) bereits drei Tage nach der Inokulation eingetreten war. Resumen Reversión de un virus de bursitis infecciosa aviar muy virulento, parcialmente atenuado mediante ingeniería genética, durante una infección en pollos comeciales Un virus de bursitis infecciosa aviar adaptado a cultivo celular y molecularmente clonado (BD-3tc) fue generado a partir de una cepa muy virulenta una aproximación con genética reversa seguido de site-directed mutagénesis (Q253H y A284T en VP2). La patogenicidad de BD-3tc fue probada en pollos comerciales. Se incluyeron la cepa original (BD-3wt) y la clonada molecularmente (BD-3mc) para poder ser comparadas. El curso subclínico de la enfermedad, con lesiones tardías y leves seguidas de una rápida regeneración folicular de la bolsa de Fabricio en las aves inoculadas con BD-3tc, sugieren que estas sustituciones aminoacídicas atenuaron parcialmente a BD-3tc. Aún así, se observo una atrofia grave de la bolsa a los 14 días tras la inoculación. La RT-PCR juntamente con el análisis con enzimas de restricción reveló que ambas mutaciones puntuales en BD-3tc revirtieron 14 días tras la inoculación. En investigaciones posteriores se demostró que el codon para la posición aminoacídica 284 había ya revertido al fenotipo original (T284A) tres días después de la inoculación.