Portal de Periódicos da CAPES

Molecular cloning of an attenuated chicken anaemia virus isolate following repeated cell culture passage

1995; Taylor & Francis; Volume: 24; Issue: 1 Linguagem: Francês

10.1080/03079459508419057

1465-3338

D. Todd, T.J. Connor, V. Calvert, Julie L. Creelan, Brian Meehan, M. S. McNulty,

Virus-based gene therapy research

Summary The pathogenicity of the Cux‐1 isolate of chicken anaemia virus (CAV) was substantially reduced following large numbers (50 to 173) of passages in MDCC‐MSBl cells. Restriction endonuclease analysis of polymerase chain reaction (PCR)— amplified DNAs and recombinant plasmids containing DNA inserts specified by CAV that had been passaged 173 times, indicated that the population of high‐passage virus was genetically diverse. A 210‐base pair (bp) insertion, containing a 19‐bp sequence identical to four repeated sequences that are located in the putative non‐coding region of the genome was shown to have become established in the virus population by passage number 30. Individual virus isolates that were selected from the high‐passage virus population using recombinant DNA cloning and transfection methodologies varied in their pathogenicities. One cloned virus isolate, designated number 10, produced virtually no anaemia and substantially reduced levels of aplasia of the bone marrow and thymus atrophy. The pathogenicity of this isolate was restored following 10 passages in young chicks. Resume La pathogénicité de l'isolat Cux‐1 de virus de l'anémie du poulet (CAV) a été significativement réduite après un grand nombre de passages (50 à 173) en cellules MDCC‐MSB1. L'analyse de restriction par l'endonucléase de l'amplification génique (PCR) ainsi que les plasmides recombinants contenant les inserts d'ADN après 173 passages du CAV ont montré que la population de virus à passage élevé était génétiquement variée. L'insertion de 21 paires de bases contenant une séquence de 19 paires de bases identiques à 4 séquences répétées, localisées dans la probable région non codant du génome s'est révélée être établie dans la population virale à partir du 30ème passage. Les isolats individuels de virus sélectionnés à partir de la population virale, à passages élevés, en utilisant les techniques de clonage d'ADN recombinant et de transfection variaient dans leur pathogénicité. Un des isolats de virus clonés, désigné sous le numéro 10, n'a produit virtuellement aucune anémie et a substantiellement réduit les niveaux d'aplasie de la moelle osseuse et d'atrophie du thymus. La pathogénicité de cet isolat a été restaurée après 10 passages chez de jeunes poulets. Zusammenfassung Die Pathogenitt des Stammes Cux‐1 des Hühneranämievirus (CAV) war nach einer hohen Passagezahl (50 bis 173) in MDCC‐MSBl‐Zellen beträchtlich vermindert. Die Restriktionsenzym‐Analyse von DNA nach deren Amplifikation durch die Polymerase‐Kettenreaktion (PCR) und von rekombinanten Plasmiden, die DNA‐Inserte von 173 mal passagiertem CAV enthielten, ergab, daß die Population des hochpassagierten Virus genetisch verschieden war. Es wurde nachgewiesen, daß in der Viruspopulation bis zur 30. Passage eine Insertion mit 24 Basenpaaren (bp) erfolgt war. Dieses Insert enthielt eine 19 bp‐Sequenz, welche mit 4 wiederholten Sequenzen in der mutmaßlich nicht‐kodierenden Region des Genoms identisch war. Einzelne Virusisolate, die mit Hilfe der Klonierung rekombinanter DNA und Trans‐fektion aus der hochpassagierten Viruspopulation ausgewählt wurden, unterschieden sich in ihrer Pathogenität. Ein kloniertes Virusisolat, als Nummer 10 bezeichnet, verursachte praktisch keine Anämie und eine erheblich verminderte Knochenmarksaplasie und Thymusatrophie. Die Pathogenität war nach 10 Passagen in jungen Küken wiederhergestellt. Resumen La patogenicidad del aislamiento Cux‐1 del virus de la anemia del pollo (CAV) se redujo substancialmente tras realizar un elevado número de pases (50 a 173) en células MDCC‐MSB1. El análisis por endonucleasas de restricción de ADN amplificado por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y de plásmidos recombinantes conteniendo inserciones de ADN específicos del CAV que había sido pasado 173 veces, indicó que la población de virus con un elevado pase era genéticamente diversa. Se observó que una inserción de 21 pares de bases (pb) que contenía una secuencia de 19 bp idéntica a 4 secuencias repetidas localizadas en la supuesta region no codificante del genoma, se había establecido en la población de virus antes del pase 30. Aislamientos individuales de virus seleccionados a partir de pases elevados empleando clonaje con ADN recombinante y transfección tuvieron una actividad patógena diferente. Un aislamiento de virus clonado designado con el número 10 no produjo casi anemia y redujo substancialmente los niveles de aplasia de la médula ósea y de atrofia túnica observada en esta enfermedad. La patogenicidad de este aislamiento se recuperó tras realizar 10 pases en pollitos.