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Le rôle du calcium dans l'activité et la stabilité de quelques protéinases bactériennes

1950; Elsevier BV; Volume: 6; Linguagem: Francês

10.1016/0006-3002(50)90097-7

1878-2434

Luigi Gorini,

Enzyme Structure and Function

La production de protéinases par toute une série de bactéries (M. lysodeikticus, B. megatherium, Coccus P, Proteus sp, Ps. pyocyanea, B. mesentericus, B. subtilis et. B. cereus, cultivées en aérobiose et à pH compris entre 7 et 8, est d'autant plus forte que ces cultures se font à température plus basse, ici 26°. Le pH optimum de ces protéinases est compris entre 7 et 8. L'activité de ces protéinases, séparées de toute cellule bactérienne, est inhibée par différents réactifs du calcium: fluorure, citrate, oxalate, nitrilotriacétate (Complexone I), éthylènediamino-tétracétate (Complexone II), hexamétaphosphate de sodium. L'inactivation des diverses protéinases par ces réactifs n'est pas instantanée, et se fait d'autant plus lentement que la température est plus basse. Les diverses protéinases présentent de grandes différences de sensibilité, celle de M. lysodeikticus étant la plus sensible, complètement inactivée par tous les réactifs sauf le fluorure, celle de B. cereus étant la plus résistante puisque même la complexone II et le métaphosphate n'exercent sur elle qu'une action assez faible. L'inactivation des protéinases par les réactifs précédents peut être complètement empêchée par addition du calcium à condition que celui-ci soit ajouté sitôt fait le mélange de l'enzyme aux réactifs. Si le calcium est ajouté un temps plus ou moins long après ce mélange, l'activité initiale ne se retrouve plus qu'exceptionnellement: le processus d'inactivation par élimination du calcium, réversible au début, devient par la suite plus ou moins rapidement irréversible. D'autre part, le calcium protège les protéinases contre leur inactivation par la température. Le calcium joue ainsi un rôle fondamental d'une part dans l'activité etd'autre part dans la stabilité des protéinases bactériennes: c'est un constituant de ces enzymes; ceux-ci sont donc des métalloprotéines dans lesquelles, selon leur origine, la liaison entre protéines et calcium est plus ou moins labile. Dans son rôle de substance active vis à vis de la protéine, le calcium ne peut être remplacé que par le strontium et seulement pour une petite part; dans son rôle de constituant de la molécule de protéinase, assurant la stabilité de la structure de l'enzyme, le calcium peut être remplacé en partie par le magnésium; mais le complexe protéine-magnésium ainsi formé, s'il conserve à la protéine sa structure fondamentale, ne possède aucune activité protéolytique. Au cours des recherches précédentes, a été mise au point et utilisée une nouvelle solution tampon, à base de méthyl- et d'éthylmorpholine, utilisable entre pH et pH 8.5, et ne contenant ni ion métallique ni substance capable de complexer le calcium. The production of proteinases by a whole series of bacteria (M. lysodeikticus, B. megatherium, Coccus P., Proteus sp, Ps. pyocyanea, B. mesentericus, B. subtilis, and B. cereus), grown aerobically and at pH 7–8, is the more, the lower the temperature; this work was carried out at 26°. The optimun pH of these proteinases is between 7 and 8. The activity of these proteinases, when separated from bacterial cells, is inhibited by various reagents for calcium: fluoride, citrate, oxalate, nitrilotriacetate (Complexon I), ethylenediamino-tetraacetate (Complexon II), and sodium hexametaphosphate. The inactivation of the various proteinases is not immediate and takes place more slowly as the temperature is lower. The sensitivity of these enzymes varies considerably. That from M. lysodeikticus is the most sensitive and is completely inactivated by all the reagents except the fluoride. That from B. cereus is the most resistant, even complexon II and the metaphosphate having only a weak action. The inactivation of the proteinases by the above-mentioned compounds can be completely prevented by addition of calcium, provided this is done immediately after addition of the reagent. If the calcium is added later, the original activity is regained only in exceptional cases. The inactivation by elimination of calcium is reversible in the beginning, but subsequently becomes more or less rapidly irreversible. On the other hand, the calcium protects the proteinases against inactivation by heat. The calcium thus plays a fundamental part in these bacterial proteinases, not only in their activation but also in their stability: it is a constituent of these enzymes, which must therefore be considered as metalloproteins in which, according to their origin, the bond between the protein and the calcium is more or less labile. The calcium in its rôle as the active substance as regards proteolysis can be replaced only by strontium and only to a slight extent. As a constituent of the proteinase-molecule, assuring the stability of the enzyme structure, calcium can be substituted partially by magnesium. However, the protein-magnesium complex so formed, although keeping the fundamental structure, has no proteolytic activity. In the course of the above-mentioned research, a new buffer solution, containing methyl- and ethylmorpholine, has been tried out. It can be used between PH 6.7 and 8.5 and includes neither metallic ions nor substances capable of forming complexes with calcium. Die Bildung von Proteinasen durch eine ganze Reihe von Bakterien (M. lysodeikticus, B. megatherium, Coccus P, Proteus sp, Ps. pyocyanea, B. mesentericus, B. subtilis und B. cereus) unter aeroben Bedingungen und bei pH 7–8 ist um so stärker, je niedriger die Temperatur gehalten wird. In diesen Versuchen wurde bei 26° gearbeitet. Das pH-Optimum dieser Proteinasen beträgt 7–8. Die Aktivität dieser Proteinasen in Abwesenheit von Bakterienzellen wird durch verschiedene Reagentien die Ca ausfällen oder komplex binden wie: Fluorid, Citrat, Oxalat, Nitrilotriacetat (Komplexon I), Äthylendiaminotetraacetat (Komplexon II), Hexametaphosphat gehemmt. Die Inaktivierung der verschiedenen Proteinasen geschieht nicht augenblicklich sondern um so langsamer, je tiefer die Temperatur ist. Die Empfindlichkeit der Proteinasen ist sehr verschieden: am empfindlichsten ist die Proteinase von M. lysodeikticus, die durch alle Reagentien mit Ausnahme von Fluorid vollständig inaktiviert wird, am widerstandsfähigsten ist die Proteinase von B. cereus, auf welche sogar Komplexon II und Metaphosphat nur eine schwache Wirkung ausüben. Die Inaktivierung der Proteinasen durch die oben erwähnten Reagentien kann durch Zugabe von Calcium vollkommen verhindert werden, wenn dieses sofort nach Zugabe des Reagens' beigefügt wird. Wird das Calcium später zugegeben, so wird die ursprüngliche Aktivität nur in Ausnahmefällen wiederhergestellt. Die Inaktivierung durch Ausscheidung des Calciums ist anfangs reversibel, wird aber dann früher order später irreversible. Andererseits schützt das Calcium die Proteinasen gegen Inaktivierung durch Wärme. Das Calcium spielt also sowohl bei der Aktivierung wie für die Stabilität der Bakterienproteinasen eine grundlegende Rolle: es ist ein Bestandteil dieser Enzyme; diese müssen daher als Metallo-Proteine angesehen werden, in denen je nach ihrem Ursprung, die Bindung zwischen Proteinen und Calcium mehr oder weniger labi ist. Als aktive Substanz der Proteolyse kann das Calcium nur durch Strontium und zwar nur zu einem kleinen Teil ersetzt werden; als Bestandteil des Proteinase-Moleküles (in diesem Fall übernimmt das Calcium die Funktion die Stabilität der Enzymstruktur zu sichern) kann das Calcium teilweise durch Magnesium ersetzt werden. Der so gebildete Protein-Magnesium-Komplex schützt zwar die Grundstruktur des Proteins, besitzt aber keinerlei proteolytische Aktivität. Im Laufe der oben beschriebenen Untersuchungen wurde eine neue Pufferlösung angewendet, die Methyl- und Äthylmorpholin enthält, Die Pufferlösung hat sich zwischen pH 6.7 und pH 8.5 gut bewährt; sie enthält weder Metallionen noch andere Substanzen die mit Calcium eine Komplex-verbindung bilden können.