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A fluorescence study of DNS-labelled chymotrypsin and related enzymes

1973; Elsevier BV; Volume: 9; Issue: 12 Linguagem: Francês

10.1016/0014-3057(73)90104-3

1873-1945

J.B. Bridge, P. Johnson,

Photosynthetic Processes and Mechanisms

Various dansyl (DNS)-conjugates of chymotrypsin, chymotrypsinogen and elastase have been prepared. Excitation and emission spectra, and fluorescence depolarization measurements have been obtained in a spectrophotofluorometer, and relevant fluorescent lifetimes have been derived from fluorescence decay measurements. Free DNS-OH gave a lifetime of 13 nsec in fair agreement with other estimates, but combined DNS gave significantly lower values. In particular, ϵ-DNS lysine in water gave a value of 4 nsec, with higher values (up to 10 nsec) at increasing glycerol concentration. Of the various protein conjugates, specifically labelled chymotrypsin gave the lowest lifetime (6 nsec); for the others, higher values were observed, the values increasing with pH of labelling. Of the protein conjugates, only in the case of specifically labelled elastase, did 'glycerol concentration cause an increase in the measured τ value from 8 to 12 nsec. Active-site labelled chymotrypsin was unusual in that its fluorescent spectrum was dependent upon excitation wavelength and its excitation spectrum upon the selected emission wavelength. The addition of further non-specifically attached DNS-groups caused a shift towards the spectra of such DNS-groups, and saturation with indole gave spectra of such a type as well as erasing wavelength dependence. It seemed that specifically attached DNS groups were probably within the “tosyl hole” but could be dislodged by indole, a competitive inhibitor. Depolarization properties were in all cases markedly dependent upon excitation wavelength. Experiments performed with varying temperature gave relaxation times which were smaller than expected for a rigid molecule with the molecular weight of chymotrypsin but, also, considerable increases were observed with increasing excitation wavelength. It seemed that the susceptibility to temperature-activated rotation of the DNS group increased with the energy of the incident radiation. At constant temperature, apart from specifically-labelled chymotrypsin, spuriously high relaxation times were observed, for which an explanation is required. Until this is provided, depolarization measurements cannot be regarded as providing a sound method of measuring relaxation times of protein molecules in solution. On a préparé divers produits de conjugaison du “dansyl” (DNS) avec la chymotrypsine, le chymotrypsinogène et l'élastase. L'utilisation d'un spectrophotofluoromètre a permis d'établir les spectres d'émission et d'excitation ainsi que de mesurer la dépolarisation de fluorescence. Des mesures de décroissance de fluorescence ont permis d'obtenir des durées de vie de fluorescence correctes. Le DNS-OH libre a une durée de vie de 13 nsec ce qui concorde bien avec les autres estimations mais le DNS combiné donne des valeurs notablement plus faibles. En particulier, l' ϵ-DNS lysine dans l'eau donne une valeur de 4 nsec, avec des valeurs plus élevées (jusqu'à 10 nsec) pour des concentrations de glycérol croissantes. Parmi les divers produits de conjugaison avec les protéines, la chymotrypsine spécifiquement marquée donne les durées de vie les plus courtes (6 nsec); pour les autres, on a observé des valeurs plus élevées, les valeurs augmentant avec le pH du marquage. Parmi les produits de conjugaison avec les protéines, seulement dans les cas de l'élastase spécifiquement marquée, on a une concentration en glycérol qui provoque une augmentation de la valeur mesure de τ de 8 à 12 nsec. La chymotrypsine ayant son site actif marqué était bizarre car son spectre de fluorescence dépendait de la longueur d'onde d'excitation et son spectre d'excitation de la longueur d'onde de l'émission sélectionnée. L'addition postérieure de groupements DNS non spécifiquement attachés provoquait un déplacement par rapport aux spectres de tels groupements DNS et la saturation par l'indole donnait des spectres d'un type tel que l'influence de la longueur d'onde était annulée. Il semble que les groupements DNS spécifiquement attachés sont probablement dans les “trous tozyl” mais peuvent étre délocalisés par l'indole, inhibiteur compétitif. Les propriétés de dépolarisation dépendaient notablement dans tous les cas de la longueur d'onde d'excitation. Les expériences effectuées à températures variables donnaient des temps de relaxation plus petits que ceux que l'on attend pour une molécule rigide ayant la masse moléculaire de la chymotripsine mais on observait également des augmentations considérables quand la longueur d'onde d'excitation augmentait. Il semble que la possibilité de rotation activée par la température des groupements DNS augmente avec l'énergie de la radiation incidente. A température constante, mise à part la chymotrypsine spécifiquement marquée, on a observé des temps de relaxations faussement élevés, ce qu'on doit expliquer. Tant que cette explication ne sera pas trouvée, on ne peut considérer les mesures de dépolarisation comme une bonne méthode donnant les temps de relaxation des molécules de protéines en solution. Si sono preparati vari conjugati dansil (DNS) di cimotripsina, cimotripsinogen e elastase. In uno spettrofotofluorometro si sono ottenuti gli spettri di eccitazione ed emissione, come pure le misure di depolarizzazione di fluorescenza, mentre le relative vite di fluorescenza sono state ricavate da misurazioni del decadimento della fluorescenza. L'DNS-OH libero ha registrato una vita di 13 nsec, ciò che concorda con altre stime, mentre DNS combinati hanno dato valori notevolmente più bassi. In particolare, l'ϵ-DNS lisina in acquá ha fornito un valore di 4 nsec, con valori più elevati (fino a 10 nsec) con concentrazioni crescenti di glicerolo. Dei vari conjugati di proteina, la cimotripsina, contrassegnata radioattivamente, ha registrato la vita media più bassa (6 nsec); per gli altri si sono osservati dei valori più elevati, tanto più quanto maggiore era il pH di contrassegno. Dei coniugati di proteine, solo nel caso dell'elastase appositamente contrassegnato, le concentrazioni del glicerolo hanno causato un aumento nel valore misurato τ: da 8 a 12 nsec. La cimotripsina contrassegnata ‘active-site’ si è dimostrata fuori del comune, per il fatto che il suo spettro fluorescente dipendeva dalla lunghezza d'onda dell-eccitazione e il suo spettro d'eccitazione dalla lunghezza d'onda dell'emissione scelta. L'aggiunta di ulteriori gruppi DNS non specificatamente attaccati ha causato uno spostamento verso gli spettri di tali gruppi DNS a le saturazione con indole ha fornito spettri di tale tipo come pure una dipendenza di lunghezza d'onda di cancellazione. E' sembrato che i gruppi DNS attaccati specificatamente erano probabilmente nell'interno del “foro tosil”, ma potevano venir spostati da indole, un inibitore competitivo. In tutti i casi le caratteristiche di depolarizzazione hanno dipeso marcatamente dalla lunghezza d'onda d'eccitazione. Gli esperimenti eseguiti con temperature variabili hanno fornito tempi di rilassamento più brevi di quanto ci si aspetti da una molecola rigida con peso molecolare della cimotripsina; si sono però osservati anche notevole aumenti con l'aumentare della lunghezza d'onda d'eccitazione. Sembra che la suscettibilità alla rotazione termoattivata del gruppo DSN aumenti con l'energia della radiazione incidente. A temperatura costante, a prescindere dall cimotripsina contrassegnata specificatamente, si sono osservati sporadici tempi di rilassamento elevati per i quali si richiede una spiegazione. Fino al momento in cui questa non viene fornita, le misurazioni di depolarizzazione non possono venir considerate come un metado attendibile per la misura dei tempi di rilassamento di molecole di proteine in soluzione. Verschiedene Dansyl-(DNS) Derivate von Chymotrypsin, Chymotrypsinogen und Elastase wurden dargestellt. Mit einem Spektrophotofluorimeter wurden Anregungs- und Emissionsspektren aufgenommen sowie Fluoreszenzdepolarisationsmessungen durchgeführt. Zugehörige Fluoreszenzzeiten wurden aus Messungen des Fluoreszenzabfalls erhalten. Freies DNS-OH ergab eine Lebensdauer von 13 nsec, was mit anderen Schätzungen gut übereinstimmt. Die Werte für gebundenes DNS waren jedoch deutlich niedriger. Im einzelnen wurde für ϵ-DNS Lysin in Wasser ein Wert von 4 nsec gefunden; die Werte erhöhten sich (bis 10 nsec) bei steigender Glyzerinkonzentration. Unter den verschiedenen Protein-DNS-Konjugaten ergab spezifisch markiertes Chymotrypsin die niedrigste Lebensdauer (6 nsec). Für die anderen wurden höhere Werte beobachtet, wobei diese Werte mit dem pH der Markierung zunahmen. Glyzerinzusatz ergab nur im Fall der spezifisch markierten Elastase eine Zunahme im gemessenen τ-Wert (von 8 nach 12 nsec). Im aktiven Zentrum markiertes Chymotrypsin war insofern ungewöhnlich, als das Fluoreszenzspektrum von der Anregungswellenlänge abhängig war, das Anregungsspektrum wiederum von der gewählten Emissionswellenlänge. Die Zugabe von weiteren nicht spezifisch gebundenen DNS-Gruppen verursachte eine Verschiebung zum Spektrum solcher DNS-Gruppen; Sättigung mit Indol ergab auch Spektren solchen Typs, zugleich verschwand die Wellenlängenabhängigkeit. Es schien, daβ die spezifisch angeknüpften DNS-Gruppen wahrscheinlich innerhalb des “Tosyl-Lochs” waren, aber durch Indol als kompetitiven Inhibitor ersetzt werden konnten. Die Depolarisationseigenschaften waren in allen Fällen deutlich abhängig von der Anregungswellenlänge. Experimente bei verschiedenen Temperaturen ergaben Relaxationszeiten, die kleiner waren, als für ein starres Molekül mit dem Molekulargewicht des Chymotrypsins erwartet, doch wurde auch eine beträchtliche Zunahme mit wachsender Anregungswellenlänge festgestellt. Es schien, daβ die Neigung zu Temperatur-aktivierter Rotation der DNS-Gruppe mit der Energie der erregenden Strahlung zunahm. Bei konstanter Temperatur wurden, abgesehen von spezifisch markiertem Chymotrypsin, abnorm hohe Relacationszeiten beobachtet. Hierfür ist noch eine Erklärung vonnöten. Bis diese gegeben ist, können Depolarisationsmessungen noch nicht als zuverlässige Methode zur Messung von Relacationszeiten von Proteinen in Lösung betrachtet werden.