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Cultivation and characterisation of avian lymphocytes with natural killer cell activity

1986; Taylor & Francis; Volume: 15; Issue: 3 Linguagem: Inglês

10.1080/03079458608436314

1465-3338

Karel A. Schat, B. W. Calnek, Daniel Weinstock,

Animal Disease Management and Epidemiology

Summary Conditioned medium (CM), as a presumed source of lymphokines including interleukin‐2, was prepared from chicken spleen cell cultures stimulated with concanavalin A (con A). When CM was used to cultivate spleen cells from 6‐ to 8‐week‐old P‐2 chickens, eight of nine spleens yielded cell lines which grew continuously for at least 50 days. Six of the cultures were tested for natural killer (NK) cell activity against LSCC‐RP9, a lymphoblastoid cell Une known to be susceptible to NK cells, and against several Marek's disease lymphoblastoid cell lines (MDCC‐CU2, ‐CU36 and ‐MSB‐1). All six cultures lysed the RP9 cells in a chromium release assay with high levels of specific release (30 to 50%) at effector cell to target cell ratios of 5:1 or 10:1. CU2 and CU36, which are NK‐cell resistant, were not lysed, while there was a low level of specific activity against MSB‐1. The cells were characterised for surface and internal antigens with monoclonal antibodies and were negative for thymocyte antigen, IgM, a T cell antigen also present on granulocytes and red blood cells, and two antigens found in macrophages. Two of the six lines examined had a low number of cells expressing la antigen, while the other fourwere negative. An antigen present on circulating T cells and a macrophage (sub)population was present on all lines. The majority of the cells had the morphological appearance of mammalian large granular lymphocytes (LGL) with a rather small kidney‐shaped nucleus. Granules and vacuoles were present in the cytoplasm. However, there was a variable percentage of lymphoblastoid (LB) cells also present. Cell lines established with CM from con A‐stimulated spleen lymphocytes in other studies were also shown to have high levels of NK activity regardless of the relative proportions of cells with the morphological appearance of LGLs or LBs, or the relative frequency of expression of the two T cell markers or la antigen, all of which varied markedly. Resume Un milieu conditionné (CM) présumé être une source de lymphokines incluant l'interleukine‐2, a été préparé à partir de cellules de rate de poulets stimulées par la concanavaline A (con A). Lorsque le CM a été utilisé pour la culture de cellules de rate de poulets P‐2 âgés de 6 à 8 semaines, huit des neuf rates ont fourni des lignées cellulaires à croissance continue pendant au moins 50 jours. Six de ces cultures ont été testées pour l'activité naturelle des cellules tueuses (NK) contre la lignée cellulaire lymphoblastolde LSCC‐RP9, connue pour sa sensibilité aux cellules NK ainsi que contre diverses lignées cellulaires lymphoblastoldes de la maladie de Marek (MDCC‐CU2, ‐CU36 et ‐MSB‐1). Toutes les six cultures ont lysé les cellules RP9 dans un test de relarguage du chrome avec de hauts niveaux de relarguages spécifiques (30 à 50%) à des taux de cellules effectrices sur cellules cibles de 5:1 ou 10:1. Les cellules CU2 et CU36 qui sont NK résistantes n'ont pas été lysées bien qu'elles avaient un niveau bas d'activité spécifique vis‐à‐vis de MSB‐1. Les cellules ont été caractérisées à l'aide d'anticorps monoclonaux pour les antigènes de surface et internes et ont été négatives pour l'antigène de thymocyte, les IgM, un antigène de cellule T également présent sur les granulocytes et les globules rouges ainsi que pour deux antigènes trouvés dans les macrophages. Deux des six lignées examinées avaient un nombre faible de cellules exprimant l'antigène la alors que les quatre autres étaient négatives. Un antigène présent sur les cellules circulantes T et une (sous) population de macrophages étaient présents chez toutes les lignées. La majorité des cellules avaient l'apparence morphologique des lymphocytes de mammifères à large granulation (LGL) avec un noyau plus petit en forme de rein. Des granules et des vacuoles étaient présents dans le cytoplasme. Cependant, il y avait un pourcentage variable de cellules lymphoblastoldes (LB) aussi présentes. Les lignées cellulaires établies avec le CM à partir de lymphocytes de la rate stimulées par la con‐A ont montré également dans d'autres études précédentes des hauts niveaux d'activité NK, sans prendre en compte en raison de variations prononcées, les proportions relatives des cellules ayant l'apparence morphologique de LGLs ou LBs ou la relative fréquence d'expression des deux marqueurs de cellules T ou de l'antigène la. Zusammenfassung Das geeignete Medium (CM), als notwendige Quelle von Lymphokinen, inclusive Interleukin‐2, wurde aus Hühnermilzzellkulturen hergestellt und mit Concana‐valin A (con A) stimuliert. Wurde CM benutzt um Milzzellen von 6 — 8 Wochen alten P‐2 Küken zu kultivieren, so wurden aus acht von neun Milzen‐Zellinien gewonnen, die mindestens 50 Tage kontinuierlich wuchsen. Sechs der Kulturen wurden geprüft auf ihre natürliche Killer (NK)‐zellaktivität gegen LSCC‐RP9, eine Lymphoblastenzellinie, die für ihre Empfänglichkeit gegen NK‐Zellen bekannt ist und gegen verschiedene Marèklymphoblastenzellinien (MDCC‐CU2, ‐CU36 und ‐MSB‐1). Alle sechs Kulturen lösten die RP9 Zellen in einem Chromfreisetzungstest mit hohen Graden von spezifischer Freisetzung (30 bis 50%) auf, bei einem Effektorzell zu Targetzellverhältnis von 5:1 oder 10:1. CU2 und CU36, die NK‐zellresistent sind, wurden nicht aufgelöst, während gegen MSB‐1 ein geringes Maß von spezifischer Aktivität bestand. Die Zellen wurden auf Oberflächen und interne Antigene mit Monoklonalen antikörpern untersucht und erwiesen sich als negative in Bezug auf Thymozytenantigen, IgM, ein T‐Zellantigen, das auf Granulozyten und Roten Blutzellen vorhanden ist und zwei in Makrophagen gefundene Antigene. Zwei der sechs untersuchten Linien besaßen einige wenige Zellen mit la Antigen, während die anderen vier negativ waren. Ein auf zirkulierenden T‐Zellen vorhandenes Antigen und eine Makrophagen (Sub)‐population war auf allen Linien nachweisbar. Die meisten Zellen sahen morphologisch wie große Granulozyten (LGL) der Säugetiere mit einem ziemlich kleinen nierenförmigen Kern aus. Im Cytoplasma waren Granula und Vakuolen vorhanden. Außerdem war ein variierender Prozentsatz von Lymphoblastenzellen (LB) anwesend. In anderen Untersuchungen war ebenfalls gezeigt worden, daß mit CM aus con A stimulierten Milzlymphozyten errichtete Zellinien hochgradige NK‐aktivifät besitzen unabhängig von dem relativem Verhältnis der Zellen mit morphologischem LGL‐ oder LB‐Aussehen oder der relativen Häufigkeit des Vorhandenseins der zwei T‐Zellmarker oder la Antigen, welche alle stark variierten. Resumen Un medio acondicionado (MA) como una supuesta fuente de linfoquinas, incluyendo el interleukin‐2, fue preparado a partir de cultivos de células de bazo de pollo estimuladas con concanavalina A (con A) cuando el MA fue usado para cultivar las células de bazo de pollos de 6 a 8 semanas de edad, pollos P‐2, ocho de nueve bazos dieron lugar a lineas celulares las cuales crecieron continuamente por al menos 50 días. Seis de los cultivos fueron probados buscando su actividad para las células asesinas naturales (AN) con la LSCC‐RP9, una linea celular linfoblastoide conocida por ser susceptible a las células AN y contra varias lineas celulares linfoblastoides de la enfermedad de Marek (MDCC‐CU2, CU36 y MSB‐1). Los seis cultivos Usaron las células RP9 en una prueba de liberación de cromio con altos niveles de liberación especial (30 a 50%) de la célula electora a la célula objetivo en una relación de 5:1 ó 10:1. Las lineas CU2 y CU36 las cuales son resistentes a las células AN, no fueron lizadas mientras que hubo un nivel bajo de actividad especifica contra la MSB‐1. Las células fueron caracterizadas por medio de antigenos de superficie e internos con anticuerpos monoclonales, habiendo sido negativos para el antígeno de timocito, IgM, un antígeno de célula T, también presente en granulocitos y glóbulos rojos y dos antigenos hallados en macrófagos. Dos de las seis lineas examinadas tenían un número bajo de células que contenían ant'igeno la, mientras que las otras cuatro fueron negativas. Un antigeno presente en células T circulantes y una (sub) población de macrófagos estaba presente en todas las lineas. La mayoria de las células presentaba una apariencia morfológica de grandes linfocitos granulares de mamífero (GLG) con un núcleo bastante pequeño en forma de riñón. Se encontraron gránulos y vacuolas en el citoplasma. Sin embargo, existió un porcentaje variable de células linfoblastoides (CL). Las lineas celulares establecidas con el MA con linfocitos de bazo estimulados con A en otros estudios se demostró también que tenían altos niveles de actividad de AN, a pesar de proporciones relativas de células con apariencia morfológica de GLG y de CL o la frecuencia relariva de expresión de las dos células T marcadoras o antigeno la, todas las cuales variaron enormemente. Notes This work was supported in part by Public Health Service Grant ROI CA 06709–23 from the National Cancer Institute.