Portal de Periódicos da CAPES

Étude des bandes chromosomiques du porc et de trois différentes souches de rein de porc en culture (PK 15, F et RP)

1973; BioMed Central; Volume: 5; Issue: 1 Linguagem: Francês

10.1186/1297-9686-5-1-1

1297-9686

G. Echard,

Metallurgy and Material Science

Depuis 1970 , différentes techniques cytologiques ont montré l'existence d'une succession de bandes sombres et claires le long des chromosomes humains.Ces bandes sont caractéristiques d'un chromosome donné.Les techniques employées chez l'homme sont ici adaptées à des cultures de sang de porc et à trois différentes souches de rein de porc en culture (PK 15 , F et RP); elles comportent un prétraitement suivi par une coloration classique au Giemsa.Les prétraitements utilisés ont été, soit une dénaturation ménagée à la chaleur, soit une « dénaturation » à la soude suivie d'une « renaturation », ou encore une dégradation enzymatique à la trypsine ou la pronase.Ces traitements ont permis d'obtenir le caryotype à bandes du porc puis d'étudier les modifications du caryotype et l'évolution de certains chromosomes des souches cellulaires cul- tivées ; en effet les bandes chromosomiques de certains chromosomes marqueurs permettent d'expliquer leur origine.compléter l'étude des anomalies chromosomiques et de faciliter la localisation de groupes de gènes sur un chromosome.Ce dernier problème étant l'un des objectifs du laboratoire, il a paru utile d'étudier, à l'aide des techniques de bandes, le caryotype des souches de rein de porc (PK 15, F et RP) maintenues en culture.Cette étude nécessitait une connaissance préalable des bandes chromosomiques chez le porc. I. -MATÉRIEL ET TECHNIQUESA. -Différentes souches et méthodes de culture i. Culture de sang de porc.Le caryotype normal du porc a été étudié à partir de cultures de leucocytes selon la technique classique de M OORHEAD et al., 19 6 0 , adaptée au sang de porc par H AAG et N IZ Z A i 9 6 9 .Quelques modifications ont cependant été apportées à cette technique.Les cultures sont effectuées soit en du milieu 190 soit en du milieu NCTC 109 auquel est ajouté 25 p. 100 de sérum de veau foetal.Le milieu est complémenté en phytohémagglutinine Difco à la concentration de 0 , 05 ml de PHA P + o,i ml de PHA M pour z 5 ml de milieu de culture.Le sang hépariné a été recueilli dans des conditions de stérilité suffisantes au moment de l'abattage de porcs.Après décantation pendant une à deux heures, la partie du surnageant la plus proche des hématies est prélevée et 10 gouttes de suspension de leucocytes sont mises en culture dans 25 ml de milieu.L'arrêt des cultures est effectué soit après 41 -42 heures, soit après 68-70 heures à 3 8 0 (H AAG et N IZZA , ig6g) après un blocage à la colchicine de deux à quatre heures à des concentrations de 0 , 2 à 0 , 4 [L g/mI.Deux types de milieu hypotonique ont été utilisés, soit une solution de KCI à 0 , 7 p. 100 et dont la durée d'action est de 20 minutes, soit une solution hypotonique contenant z6 p. ioo de sérum de veau foetal auquel est ajouté 250 ooo UI de hyaluronidase.Le meilleur temps d'action de ce dernier milieu est de 35 à 4 o minutes.Les cellules sont fixées à l'aide d'un Carnoy sans chloroforme et étalées sur lame selon la méthode classique de R OTHFELS et S IMINOVITCH ( 195 8).2 .Culture des souches cellulaires PK 15, F et RP.selon la souche et le milieu utilisé, les temps d'action se situent entre 25 et q 5 minutes à 37 °.Les cellules sont fixées dans le tube par deux bains au minimum de Carnoy sans chloroforme pendant des temps variant de 2 heures à z.l heures. B. -Traitement et coloration des lamesLes techniques mises au point au cours de ces deux dernières années en vue d'obtenir des chromosomes à bandes caractéristiques, se divisent actuellement en 5 catégories : I .Les techniques de fluovescence (C ASPERSS ON et al., 1970 ).En utilisant les propriétés de la moutarde quinacrine (Quinacrine Mustard Dihydrochloride) qui, par alkylation se fixe au niveau de l'atome N de la Guanine et s'intercale dans la double hélice, on obtient des bandes fluorescentes le long des chromosomes et la distribution de ces bandes est caractéristique de chaque paire d'homologues.Les régions les plus fluorescentes correspondraient à des zones où l'ADN chromosomique est riche en groupements GC.Les mêmes bandes sont aussi obtenues avec d'autres agents fluorescents.Le principal inconvénient de cette technique réside dans la courte durée de la fluorescence lors de l'éclairement : après 4 minutes son intensité peut avoir diminué de 5 o p. 100 .Pour cette raison les essais entrepris sur les différentes souches de porc ont été abandonnés au profit des techniques suivantes.2 .Les techniques dites de a D é nituration-rcnatuvation ».Elles ont été énoncées par P ARDUE et G ALL ( 1970 ) et complétées par A RRIG HI et Hsu (1971) dans le but d'étudier l'hétérochromatine chez l'Homme.Ces techniques consistent à provoquer une dénaturation de l'ADN par la soude, ou un autre agent dénaturant, et à produire ensuite une « renaturation n par un tampon SSC (saline citrate solution).Cette « renaturation » serait plus rapide dans les zones qui présentent des séquences hautement répétitives de DNA.La coloration au Giemsa après ce traitement indiquerait que les bandes chromosomiques très noires corres- pondent à des zones où l'ADN est hautement répétitif.Des modifications de la technique de base ont été apportées par les différents auteurs, en particulier par D RETS et S HAW ( 1971 ).Les meilleurs résultats sont obtenus en utilisant NaOH 0 , 07 M pendant des temps courts variant de 2 à 6 0 secondes, suivi par un passage dans un bain de SSC ( 2 SSC jusqu'à 12 SSC) pendant 1 2 à z 4 heures entre 6 0 et 70 °.Cette technique a été adaptée aux cultures de leucocytes et aux différentes lignées de rein de porc.Ses modalités sont les suivantes :-