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Establishment and evaluation of a multiplex polymerase chain reaction for detection of mycobacteria and specific identification of Mycobacterium tuberculosis complex

1995; Churchill Livingstone; Volume: 76; Issue: 4 Linguagem: Inglês

10.1016/s0962-8479(05)80033-4

1532-219X

Abu Salim Mustafa, Ali Ahmed, Adnan T. Abal, T.D. Chugh,

Veterinary medicine and infectious diseases

To establish a multiplex polymerase chain reaction for detection of mycobacteria and specific identification of Mycobacterium tuberculosis complex and to evaluate the test in the diagnosis of tuberculosis. Three sets of primers were used to amplify 383 bp, 240 bp and 131 bp DNA fragments from the genes encoding the 65 kDa, MPB64 and the 19 kDa proteins of M. tuberculosis in a single reaction tube. Reaction conditions were optimized with respect to the requirement of DMSO, concentration of MgCl2, annealing and denaturation temperatures and number of amplification cycles. Inhibitory activity in clinical samples was identified by amplifying a 500 bp DNA fragment of the phage lambda along with the mycobacterial targets within the same reaction tube. The multiplex PCR was evaluated in differentiating M. tuberculosis complex from other mycobacteria and in the diagnosis of tuberculosis by testing clinical specimens. Amplification of the 383 bp DNA fragment was specific to the genus Mycobacterium. The 240 bp DNA fragment was amplified from M. tuberculosis complex and M. fortuitum and the 131 bp DNA fragment was amplified from the mycobacteria of M. tuberculosis complex and M. scrofulaceum. All the three bands were amplified only from M. tuberculosis complex. Applicability of the multiplex PCR is demonstrated in differentiating M. tuberculosis complex from other mycobacteria by using standard strains and clinical isolates. The multiplex PCR was also useful in the detection of inhibitory activity and in the identification of M. tuberculosis complex directly in clinical samples. The multiplex PCR established in this study could differentiate M. tuberculosis complex from other mycobacteria. This test may also be helpful in the early and specific diagnosis of tuberculosis. Mise au point d'une réaction de polymérisation en chaîne (PCR) multiplexe pour la détection de mycobactéries et pour l'identification précise du complexe Mycobacterium tuberculosis, et évaluer cet essai pour le diagnostic de la tuberculose. Trois couples d'amorce ont été utilisés afin d'amplifier les fragments d'ADN 383 pb, 240 pb et 131 pb à partir des gènes qui codent pour les protéines de 65 kDa, MPB64 et 19kDa de M. tuberculosis dans un même essai. Les conditions expérimentales ont été optimisées, concentration en DMSO et MgCl2, températures d'appariement et de dénaturation ainsi que le nombre de cycles d'amplification. L'activité inhibitrice dans les échantillons cliniques a été identifiée en amplifiant un fragment d'ADN de 500 pb du phage lambda ainsi que les séquences mycobactériennes dans le même tube de réaction. La PCR multiplexe a été évaluée en montrant la différentiation du complexe M. tuberculosis des autres mycobactéries et par le diagnostic de la tuberculose par l'examen des échantillons cliniques. L'amplification du fragment ADN de 383 pb est spécifique du genre Mycobacterium. L'amplification du fragment d'ADN de 240 pb a été recherché à partir du complexe M. tuberculosis et de M. fortuitum. De la même façon l'amplification du fragment de 131 pb a été recherchée à partir du complexe M. tuberculosis et de M. scrofulaceum. Les trois séquences ont été amplifiées seulement à partir du complexe M. tuberculosis. L'application de la PCR multiplexe est démontrée par la différentiation du complexe M. tuberculosis des autres mycobactéries en utilisant des souches et des isolats cliniques standards. La PCR multiplexe a également été utile pour la détection de l'activité inhibitrice et pour l'identification directe du complexe M. tuberculosis dans des échantillons cliniques. La PCR multiplexe mise au point au cours de cette étude permet de différencier le complexe M. tuberculosis des autres mycobactéries. Ce test peut également être utilisé pour le diagnostic précoce et spécifique de la tuberculose. Establecer una reacción en cadena de la polimerasa múltiple para la detección de micobacterias y la identificación específica del complejo Mycobacterium tuberculosis y evaluar el test para el diagnóstico de la tuberculosis. Se utilizaron tres grupos de iniciadores para amplificar fragmentos de ADN 383 bp, 240 bp y 131 bp, a partir de genes que codifican para las proteínas 65 kDa, MBP64 y 19 kDa de M. tuberculosis en un solo tubo de reacción. Las condiciones de la reacción fueron optimizadas con respecto a los requerimientos de DMSO, concentración de MgCl2, temperaturas de apareamiento y de desnaturación y número de ciclos de amplificación. Se identificó la actividad inhibitoria en muestras clínicas, amplificando un fragmento de ADN de 500 bp del fago lambda, así como las secuencias micobacterianas dentro del mismo tubo de reacción. La PCR múltiple fue evaluada diferenciando el complejo M. tuberculosis de otras micobacterias y para el diagnóstico de la tuberculosis sometiendo a test las muestras clínicas. La amplificación del fragmento ADN 383 bp fue específica para el género Mycobacterium. El fragmento ADN 240 bp fue amplificado a partir del complejo M. tuberculosis y M. fortuitum y el fragmento ADN 131 bp fue amplificado a partir de micobacterias del complejo M. tuberculosis y M. scrofulaceum. Las tres secuencias fueron amplificadas sólo a partir del complejo M. tuberculosis. Se demuestra la aplicabilidad de la PCR múltiple para la diferenciación del complejo M. tuberculosis de otras micobacterias utilizando cepas y aislados clínicos estándar. La PCR múltiple también fue útil para la detección de la actividad inhibitoria y para la identificación del complejo M. tuberculosis directamente en muestras clínicas. La PCR múltiple establecida en este estudio podría diferenciar M. tuberculosis de otras micobacterias. Este test también puede ser útil para el diagnóstico precoz y específico de la tuberculosis.