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Alteración en la diferenciación de células dendríticas inmaduras humanas por adenocarcinomas pulmonares

2002; Volume: 15; Issue: 3 Linguagem: Espanhol

0187-7585

Federico Ávila Moreno, Carmen Sánchez Torres, Amaranta Rivas Carvalho, Heriberto Prado García, José Sullivan López González,

vaccines and immunoinformatics approaches

Introduction: Differentiation and maturation of dendritic cells (DCs) are characterized by changes in their phenotype and function. The DCs participation is crucial in the induction of an antitumor immune response. It has been reported that lung carcinomas elude the immune response using various strategies. Alterations in the DCs differentiation by lung adenocarcinoma, however, have not been described. Objective: To study alterations on the differentiation from monocytes to immature DCs (iDCs) due to soluble factors released by lung adenocarcinoma. Material and methods: CD14+ monocytes purified from peripheral blood mononuclear cells (MNC) were cultured with GM-CSF and IL-4 to induce differentiation to iDCs. Using the same procedure, soluble factors released from three different adenocarcinoma cell lines or from MNC (control) were added to the monocyte cultures. Changes in the percentage of positive cells and in the expression of CD14, HLA-DR, CD1a, CD32, CD40, CD11b, CD80, CD86 and CD83 molecules, measured as mean of fluorescence intensity (MF), were detected using flow cytometry. Proliferation rate was evaluated from co-cultures of iDCs and allogeneic T cells. Results: The soluble factors released by three lung adenocarcinoma lines tended in the iDCs to reduce the expression of CD1a, and to increase the percentage of cells and the expression of CD32. Only one cell line tended to increase the expression of HLA-DR. Inhibition of allogeneic T cells proliferation was detected when iDCs (previously stimulated with supernatants from tumor cells) were added to the co-cultures. Conclusion: Adenocarcinoma cell lines altered the differentiation process from monocytes to iDCs. Our results suggest that iDCs expressed a macrophage-like phenotype. This type of iDCs induced a strong inhibition on the proliferation rate of allogeneic T cells. DCs with these alterations might induce tolerance to the tumor antigens, blocking the induction of an efficient immune response against the tumor. INTRODUCCION Las celulas dendriticas (DCs, por sus siglas en ingles) derivan de precursores hematopoyeticos (celulas CD34+ de medula osea, monocitos, etcetera) y para su generacion requieren dos procesos: i) diferenciacion y ii) maduracion1. Las DCs pertenecen al sistema de celulas presentadoras de antigeno profesionales (APC) y se ha considerado que son las mas eficientes en activar a linfocitos T (LT) virgenes para la induccion de una respuesta inmune primaria1,2. En los tejidos, las DCs intersticiales se encuentran en estadio inmaduro (iDCs). En este estadio muestran caracteristicas morfologicas como prolongaciones membranales tipo dendritas y, caracteristicas fenotipicas entre las que se encuentran: baja expresion de moleculas codificadas por el MHC, de moleculas de adhesion y coestimuladoras3, asi como la induccion de moleculas de presentacion de antigenos no peptidicos (CD1a-d, entre otros)4. Con relacion a su funcionalidad, las iDCs poseen elevada capacidad de internalizar antigenos a traves de tres procesos: fagocitosis, endocitosis mediada por receptores especificos y macropinocitosis constitutiva5. Los receptores que median la captacion de antigenos son: FcγR (CD32 y CD64)6, FceRII (CD23), FcαR, receptores para factores del complemento, receptores Toll y receptores de naturaleza lectina tipo C con dominios de union a carbohidratos como receptor de manosa (MR), DEC-205, langerina, dectina, DCSIGN, entre otros7. En respuesta a estimulos inflamatorios, las iDCs migran de los tejidos u organos perifericos a los organos linfoides secundarios. Durante la migracion, las iDCs regulan diferencialmente la expresion de receptores para quimiocinas, disminuyen la expresion de moleculas involucradas en la captura del antigeno (FcR, MR, etcetera) e incrementan la expresion tanto de moleculas del MHC como de moleculas coestimuladoras, asi como la liberacion de citocinas (IL-12, IL-1β, IFN-γ, TNF-α, etcetera). Se considera que en esta etapa, las DCs han alcanzado el estadio de maduracion (mDCs) adquiriendo caracteristicas que les permite participar eficientemente como APC8. A partir de cultivos de monocitos (CD1a-, CD14+) se ha logrado la generacion de DCs mediante la adicion de distintas citocinas. En particular, Sallusto y colaborador3 han reportado que la adicion conjunta del factor estimulador de colonias de granulocitos y macrofagos (GM-CSF) e interleucina-4 (IL-4) a monocitos induce su diferenciacion a iDCs y la combinacion de estas citocinas con TNF-α induce su maduracion a mDCs9-12. La Tabla I muestra algunas de las moleculas asociadas al fenotipo de monocitos, iDCs y mDCs. Alteracion en la diferenciacion de celulas dendriticas inmaduras humanas por adenocarcinomas pulmonares Vol. 15, No. 3 Julio septiembre 2002 137 edigraphic.com Dada la importancia que tienen las DCs en la induccion de la respuesta inmune, se han iniciado estudios sobre su participacion en la respuesta inmune antitumoral13. Se ha detectado la presencia de DCs que infiltran al tumor en varios tipos de carcinomas incluyendo el de pulmon14-18. Algunos autores han sugerido una relacion directa entre mayor numero de DCs infiltrantes con un mejor pronostico14,15,19,20. Esta asociacion ha contribuido a destacar la importancia que tienen las DCs en el cancer. Por otro lado, se ha reportado que algunas neoplasias alteran el fenotipo o funcionamiento de DCs21-24. Durante el desarrollo maligno se establece una interaccion compleja entre celulas tumorales, celulas del sistema inmune y celulas del estroma, generandose un microambiente constituido por distintos factores provenientes de diversos tipos celulares, los que influyen en las celulas neoplasicas como en las celulas de la respuesta inmune. Previamente, hemos reportado que factores solubles liberados por carcinomas pulmonares afectan la produccion de TNF-α por monocitos25. A la fecha, no tenemos conocimiento de reportes que estudien el efecto de adenocarcinomas pulmonares en la generacion de DCs, por lo que nuestro grupo estudio el efecto de factores solubles secretados por lineas celulares de adenocarcinoma en el proceso de diferenciacion in vitro de monocitos a iDCs. MATERIAL Y METODOS Reactivos Se emplearon las citocinas recombinantes GM-CSF a la concentracion de 1000U/mL (PharMingen, San Diego, CA) e IL-4 a la concentracion de 15ng/mL (Calbiochem, La Jolla, CA). Anticuerpos para separacion negativa de LT CD3+ y anticuerpos anti-CD14, ambos acoplados a microesferas metalicas (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany). Anticuerpos monoclonales de raton anti-CD14, anti-HLA-DR, anti-CD1a, anti-CD32, antiCD40, anti-CD11b, anti-CD80, anti-CD83 y anti-CD86 obtenidos de PharMingen. El anticuerpo secundario policlonal de cabra contra inmunoglobulinas de raton acoplado a FITC fue obtenido de Dako (Carpinteria, CA). Lineas celulares de adenocarcinoma pulmonar Se emplearon tres lineas celulares de adenocarcinoma pulmonar la SK-LU-1 obtenida del American Type Culture Collection (ATCC), asi como las lineas celulares 1.3.11 y 3B1A generadas de pacientes y reportadas previamente26. Ademas, celulas mononucleares (CMN) de sujetos sanos. Las celulas tumorales y CMN se cultivaron empleando medio RPMI-1640 adicionado con 10% de suero fetal bovino inactivado, L-glutamina 2mM, piruvato de sodio 1mM, aminoacidos no esenciales 1%, (Hyclone Logan, UT), penicilina/estreptomicina al 1% y 2-mercapto-etanol 50μM (Gibco/BRL, Grand Island, NY). Obtencion de sobrenadantes Las celulas tumorales (1x106) o las CMN (5x106) se cultivaron en 10mL de medio de cultivo por 24h. Se recupero el sobrenadante (SN) por centrifugacion a 250 x g durante 10min e inmediatamente se procedio a su congelacion. Previo a su adicion a los cultivos de monocitos, los SN se mezclaron en proporcion 1:1 con medio RPMI-1640 conteniendo 10% de suero humano. Separacion y purificacion de monocitos Mediante leucoferesis se obtuvieron concentrados leucocitarios de dos donadores sanos, se separaron las CMN empleando gradientes de densidad usando FicollHypaque (Gibco/BRL). Los monocitos fueron purificados por seleccion positiva empleando anticuerpos anti-CD14 unidos a microesferas metalicas. La pureza y viabilidad de la poblacion en estudio siempre fue superior al 96%. Diferenciacion de celulas CD14+ a DCs inmaduras Los monocitos purificados (CD14+) fueron cultivados a una densidad de 1 x 106 cel/mL en placas de 12 pozos (Costar, Cambridge, MA) por seis dias, adicionando GMCSF e IL-4 al inicio del cultivo y renovado cada dos dias. Para estudiar el efecto que el adenocarcinoma pulmonar causa en las iDCs, se adiciono SN proveniente de cada Tabla I. Expresion de marcadores de diferenciacion y maduracion en DCs de origen monocitico. Moleculas Monocitos iDCs MDCs Receptor para LPS CD14 +++ +/Receptores Fc CD32 ++ + +/CD64 ++ +/Adhesion CD11b ++ + + CD11c + ++ ++ ICAM-1 y 2 + ++ +++ Coestimuladoras CD40 + ++ +++ CD80 +/++ CD86 +/+ ++ Presentadoras de antigeno HLA-ABC, DP, DQ + ++ +++ HLA-DR + ++ +++ CD1a ++ + Maduracion/Activacion CD83 +/+ CD45 RO ++ ++ Adaptada de1. iDCs: Celulas dendriticas inmaduras; mDCs: Celulas dendriticas maduras; LPS: Lipopolisacarido. Grado de expresion: negativo; +/variable; + bajo; ++