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Clonagem e expressão do gene da L-Asparaginase de Geobacillus stearothermophilus em Bacillus subtilis K07

2017; UNIVERSIDADE EST.PAULISTA JÚLIO DE MESQUITA FILHO; Volume: 38; Linguagem: Português

2179-443X

Graciely Gomes Corrêa, Carolina Martinucci Giaretta, Milca Rachel da Costa Ribeiro Lins, Jorge F. B. Pereira, Danielle Biscaro Pedrolli,

Science and Education Research

Introducao: Enzimas provenientes de microorganismos extremofilos, como o Geobacillus stearothermophilus, tem grande potencial biotecnologico, por apresentarem maior estabilidade termica. Porem, o cultivo desses microrganismos e custoso e a produtividade baixa. Portanto, a producao heterologa dessas enzimas em linhagem hospedeira poupa recursos. Amplamente usada no tratamento de Leucemias Linfoblasticas Agudas (LLA), a L-Asparaginase (ASNase) e uma enzima que atua diminuindo a concentracao de L-asparagina livre no plasma e, dessa forma, impede a proliferacao de celulas cancerigenas. Isso ocorre porque tais celulas, ao contrario das celulas saudaveis, nao conseguem sintetizar o aminoacido L-asparagina necessario a sintese proteica, por nao possuirem a enzima asparagina sintetase devido a um silenciamento genico. Dessa forma, a ASNase tem capacidade para hidrolisar um aminoacido essencial a sobrevivencia das celulas cancerigenas da LLA, um tipo de leucemia comum na infância e que tem uma probabilidade de cura de cerca de 90%. Objetivo: Construir uma linhagem de Bacillus subtilis que produz altas quantidades de ASNase originaria de G. stereothermophilus. Metodologia: Foram desenhados primers para amplificacao do gene responsavel pela producao de ASNase em G. stearothermophilus, com e sem caudas de histidina, e primers para o promotor forte srfA de B. subtilis para clonagem no plasmideo pLike-rep. Apos a ligacao das sequencias, foi realizada a transformacao do plasmideo replicativo em celulas competentes de B. subtilis K07 - linhagem com deficiencia na producao de proteases extracelulares. Foram coletadas amostras de celulas dos clones em diferentes etapas de crescimento, as quais foram rompidas para liberacao do conteudo celular. Os extratos celulares foram submetidos a ensaios bioquimicos para determinacao da atividade enzimatica da ASNase (metodo de Nessler) e eletroforese (PAGE-SDS) para verificar qualitativamente a producao. Resultados e discussao: O sistema criado mostrou-se funcional, produzindo elevados niveis da proteina ASNase intracelular pelos clones, com e sem cauda de histidina. Alem disso, a ASNase presente no extrato celular apresentou atividade catalitica. Conclusao: Foi construido um sistema alternativo para a producao de ASNase em B. subtilis, empregando o gene de G. stearothermophilus, ate entao nao estudado. A producao industrial deste biofarmaco tem sido, tradicionalmente, realizada por Escherichia coli, contudo alguns pacientes apresentam reacao alergica ao medicamento. Novos sistemas de producao sao necessarios tanto para contornar os problemas relacionados a hipersensibilidade quanto para melhorar a qualidade do tratamento. A questao e especialmente importante para o Brasil, que tem vivido uma crise de abastecimento de ASNase nos ultimos anos devido a problemas com os fornecedores estrangeiros.