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Design de sRNA para o controle da expressão gênica em Lactococcus lactis

2017; UNIVERSIDADE EST.PAULISTA JÚLIO DE MESQUITA FILHO; Volume: 38; Linguagem: Português

2179-443X

Nathan Vinícius Ribeiro, Danielle Biscaro Pedrolli,

Animal Genetics and Reproduction

Introducao: Pequenos RNAs (sRNA) sao moleculas de RNA de 18 a 30 nucleotideos, nao-codificantes, que estao envolvidas na regulacao da expressao genica, principalmente na regulacao pos-transcricional, atraves de mudancas na estabilidade do mRNA ou na traducao. Foi mostrado recentemente que a bacteria probiotica Lactococcus lactis possui diversos processos regulados por sRNAs. Objetivo: Desenhar um sRNA que, quando expresso, seja capaz de se hibridizar a um mRNA-alvo e bloquear sua traducao, criando assim uma ferramenta simples de regulacao da expressao genica, que possa ser usada para programar circuitos genicos em L. lactis. Metodologia: A sequencia escolhida como alvo do sRNA foi a extremidade 5’UTR do mRNA que codifica a proteina verde fluorescente, previamente introduzida em L. lactis. A sequencia-alvo compreende o sitio de ligacao do ribossomo ate o codon inicial. A partir da escolha do alvo, foi utilizado o software RiboMaker para o design do sRNA, sendo estabelecido que o sRNA possuiria 50 nucleotideos e conteria sequencia complementar ao alvo associada a uma sequencia terminadora da transcricao. O software forneceu, alem das sequencias, parâmetros de energia necessaria para a hibridizacao das moleculas. Foram selecionadas as duas melhores sequencias fornecidas pelo RiboMaker (sRNA1 e sRNA2) para realizar uma simulacao utilizando o software NUPACK, a fim de prever a interacao entre o sRNA e o mRNA-alvo, e analisar a estrutura secundaria formada e sua estabilidade. Resultados e discussao: A sequencia-alvo escolhida no mRNA foi AAGGAGGACAAACAUG. O design processado no RiboMaker gerou, para o sRNA1, os valores: energia livre de hibridizacao = -16,8 Kcal/mol; energia livre de ancoragem = -7,2 Kcal/mol; energia livre necessaria para a formacao do complexo = 4,8 Kcal/mol. Para o sRNA2, obteve-se os valores: energia livre de hibridizacao = -25 Kcal/mol; energia livre de ancoragem = -19,2 Kcal/mol; energia livre necessaria para a formacao do complexo = 1,2 Kcal/mol. Pelos valores de energia obtidos, foi possivel notar que o sRNA1 provavelmente nao apresentaria um bom resultado devido, principalmente, aos altos valores de energia livre de hibridizacao e de formacao do complexo, enquanto que o sRNA2 apresentou valores mais baixos para ambas energias, mostrando assim, um melhor potencial de sucesso. Essas hipoteses foram confirmadas a partir da simulacao com o software NUPACK. Para o sRNA1, a estrutura prevista apresentou uma fraca probabilidade de hibridizacao, sendo que, em condicoes de equilibrio, haveria uma quantidade relativamente grande de moleculas nao-hibridizadas. Para o sRNA2, a estrutura prevista apresentou uma forte hibridizacao e com alta probabilidade de ocorrer, sendo que a quantidade de moleculas nao-hibridizadas nas condicoes de equilibrio seria praticamente nula. A partir desses resultados, escolheu-se o sRNA2 para ser utilizado em trabalhos futuros. Conclusao: Foi possivel desenhar de forma racional um sRNA contra uma sequencia-alvo escolhida. A simulacao da interacao entre o sRNA e o alvo indicou alta eficiencia e especificidade. Para a continuacao deste trabalho, o sRNA desenhado sera construido e testado em L. lactis.