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Internalização de peptídeos inibidores de topoisomerases em lipossomas de ramnolipídios

2017; UNIVERSIDADE EST.PAULISTA JÚLIO DE MESQUITA FILHO; Volume: 38; Linguagem: Português

2179-443X

Beatriz Cristina Pecoraro Sanches, Rodolfo dos Santos Carrijo, Camila Rocha Aguiar, Thaís Azevedo Benites, Milena Barbosa da Conceição, Patrícia Bento da Silva, Jonas Contiero, Marlus Chorilli, Reinaldo Marchetto,

Science and Education Research

Introducao: Os sistemas toxina-antitoxina (TA) sao compostos por uma toxina e uma antitoxina. ParE-ParD e um sistema TA tipo II, onde ParE atua como toxina (12 kDa) e ParD antitoxina (9 kDa). ParE tem atividade de inibicao da DNA girase, enzima que atua no super enovelamento, replicacao do DNA, sendo, portanto, fundamental para a manutencao celular dos procariontes. Estudos recentes mostraram que a atividade toxica desta proteina tambem inibe a atividade da Topoisomerase IV (Topo IV), enzima que cliva e religa a dupla fita de DNA apos sua catalise. Ja ParE3, um peptideo analogo a ParE tambem e capaz de inbira DNA girase e a Topo IV, sendo este um mecanismo interessante para o desenvolvimento de novos farmacos. Contudo, apesar destes aspectos promissores, constatou-se que ParE3 tem limitada inibicao do crescimento das celulas bacterianas devido sua baixa capacidade de permeabilizacao, inviabilizando seu uso. Objetivo: Considerando o alto potencial biotecnologico de ParE3, objetivou-se sua internalizacao em lipossomas constituidos de ramnolipidios, um glicolipidio de comprovada atividade antimicrobiana, com baixa toxicidade e alta biodegradabilidade, que vem sendo pouco explorado para fins nanotecnologicos. Metodologia: ParE3 foi quimicamente sintetizado pela metodologia de fase solida (SPFS), purificado e analizado por cromatografia liquida de alta eficiencia (CLAE). Para sua caracterizacao e identificacao utilizou-se a espectrometria de massas (ESI-MS). Analises eletroforeticas foram empregadas para avaliar a habilidade de ParE3 inibir da reacao de superenovelamento da DNA girase e de relaxamento da Topo IV utilizando-se a metodologia descrita pelo fabricante (Inspiralis®). Os lipossomas foram produzidos via extrusao (Avanti Lipid Polar®) com filtro de 100nm pela metodologia de hidratacao do filme lipidico, caracterizados por Dynamic Light Scattering (DLS) e Zeta Potential. Para determinar a liberacao prolongada do sistema utilizou-se membranas de acetato de celulose para dialisar o conteudo em PBS, pH: 7.2, e o monitoramento via espectrofotometro (Shimadzu). Resultados e Discussao: ParE3 mostrou atividade de inibicao de girase e topo IV ate a concentracao de IC100 = 25 μmol.L-1. Lipossomas incorporados tiveram Potencial Zeta de –30 mV; quando livres, este resultado foi de -15 mV. Lipossomas tiveram um aumento de 50% do tamanho medio quando comparados com os lipossomas vazios. A eficiencia de incorporacao (E.I.) foi de aproximadamente 40%. O peptideo incorporado foi liberado dos lipossomas em aproximadamente 3 horas. Conclusao: Os estudos mostram que apesar da utilizacao de ramnolipidios para producao de lipossomas ser pouco comum, este lipidio apresenta caracteristicas robustas o suficiente para esta finalidade. A incorporacao de ParE3 em lipossomas de ramnolipidios foi eficiente, permitiu aumento da permeabilidade e biodisponibilidade de ParE3.