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Estrutura e função da proteína GhoT de Salmonella enterica: uma toxina bacteriana implicada no fenômeno de persistência celular

2017; UNIVERSIDADE EST.PAULISTA JÚLIO DE MESQUITA FILHO; Volume: 38; Linguagem: Português

2179-443X

Rodolfo dos Santos Carrijo, Camila Aguiar Rocha, Milena Barbosa da Conceição, Beatriz Cristina Pecoraro Sanches, Thaís Azevedo Benites, Luiz Carlos Bertucci Barbosa,

Antibiotic Resistance in Bacteria

Introducao: Sistemas toxina-antitoxina (TA) sao tipicamente formados por dois genes que codificam uma toxina estavel e uma antitoxina labil. Esses modulos geneticos sao diversos e abundantes em procariotos, sendo agrupados em seis tipos (I a VI). O sistema GhoS/GhoT (tipo V) foi identificado em Escherichia coli, estando implicado no fenomeno de persistencia celular (tolerância temporaria a antibioticos). Embora a antitoxina desse sistema (GhoS) tenha sido bem caracterizada, pouco se conhece sobre a toxina (GhoT), sendo apenas demonstrado que ela atua sobre a membrana bacteriana interna formando poros. Objetivo: Considerando o potencial biotecnologico dos modulos TA como alvos para o desenho de novos antimicrobianos, esse trabalho pretendeu caracterizar funcional e estruturalmente a toxina GhoT de Salmonella enterica. Metodologia: A sequencia de aminoacidos homologa da GhoT (6,7 kDa) em S. enterica foi obtida por BLAST, utilizando a sequencia da GhoT de E. coli como referencia. As estruturas secundarias da proteina foram preditas pelo servidor PSIPRED. O polipeptideo foi sintetizado pelo metodo quimico em fase solida, sendo purificado por cromatografia liquida de alta eficiencia e identificado por espectrometria de massas. As suas propriedades conformacionais foram investigadas por dicroismo circular (CD) em tampao fosfato-salino (pH 7,2) na presenca de Trifluoroethanol (TFE) (60%) e Dodecil sulfato de sodio (SDS) (25 mmol/L). Para o estudo de permeabilizacao, lipossomas constituidos por POPE (75%), POPG (22%) e cardiolipina (3%), contendo carboxifluoresceina (CF), foram produzidos afim de simular a membrana bacteriana. A avaliacao da atividade antimicrobiana foi verificada contra as bacterias Escherichia coli O157:H7 (ATCC 43895) e Staphylococcus aureus (ATCC 14458) empregando a tecnica de microdiluicao em placas. Resultados e discussao: A proteina foi construida e isolada com sucesso. As analises in silico demonstraram que a GhoT adota predominantemente a forma de α-helice. Os dados de CD confirmaram a previsao estrutural. Tanto em TFE quanto na presenca de micelas de SDS o polipeptideo teve uma maior tendencia em se estruturar em α-helice. Quando em contato com os lipossomas a porcentagem de vazamento de CF aumentou juntamente com a concentracao da toxina, chegando a 100% de rompimento quando o teor foi de 1,25 μmol/L. Para a atividade antibacteriana, notamos que a GhoT na maior concentracao testada (80 μmol/L), mesmo atuando in vivo a partir do interior celular, inibiu consideravelmente o crescimento bacteriano (cerca de 52% para E. coli e 40% para S. aureus). Conclusao: A obtencao da GhoT por sintese quimica e o seu isolamento sao realizacoes ineditas. Os resultados alcancados para a GhoT de S. enterica confirmam a sua predicao estrutural e atividade de membrana. Alem disso, os dados revelados pelo teste antimicrobiano exibem o potencial da toxina como um possivel modelo para o desenvolvimento de novos antibioticos.