Dual sgRNA-based Targeted Deletion of Large Genomic Regions and Isolation of Heritable Cas9-free Mutants in Arabidopsis
2020; American Academy of Arts and Sciences; Volume: 10; Issue: 20 Linguagem: Inglês
10.21769/bioprotoc.3796
ISSN2331-8325
Autores Tópico(s)Photosynthetic Processes and Mechanisms
ResumoCRISPR/Cas9 system directed by a gene-specific single guide RNA (sgRNA) is an effective tool for genome editing such as deletions of few bases in coding genes. However, targeted deletion of larger regions generate loss-of-function alleles that offer a straightforward starting point for functional dissections of genomic loci. We present an easy-to-use strategy including a fast cloning dual-sgRNA vector linked to efficient isolation of heritable Cas9-free genomic deletions to rapidly and cost-effectively generate a targeted heritable genome deletion. This step-by-step protocol includes gRNA design, cloning strategy and mutation detection for Arabidopsis and may be adapted for other plant species., [摘要] CRISPR/Cas9由基因特异性单导RNA（sgRNA）引导的系统是一种有效的基因组编辑工具，如编码基因中少部分碱基的删除。然而，大区域的靶向缺失产生功能缺失等位基因，这为基因组基因座的功能解剖提供了一个直接的起点。我们提出了一个简单易用的策略，包括一个快速克隆双sgRNA载体，有效分离可遗传的Cas9游离基因组缺失，以快速且经济有效地产生靶向遗传基因组缺失。该方法包括拟南芥的gRNA设计、克隆策略和突变检测，可适用于其他植物。 [背景] CRISPR/Cas9双sgRNA定向基因敲除已成功用于多种生物体的基因组编辑（Wang等人，2013；Chen等人，2014；Char等人，2017；Cai等人，2018；Durr等人，2018；Cui等人，2019；Do等人，2019；Liu等人，2020）。基因组DNA区域的靶向缺失为功能基因组学研究提供了一个有价值的起点（Hilton和Gersbach，2015；Ford等人，2019；Gowthaman等人，2020）。基于CRISPR/Cas9的删除基因组区域的方法受益于靶DNA区域两侧的两个GRNA（肖等人，2013年；Canver等人，2014年；Kistler等人，2015年；Song等人，2016年）。在植物中，从单个转化事件中执行多重基因打靶的一个关键瓶颈是在一个二进制载体中包含多个gBlocks。gBlock由RNA聚合酶Ⅲ（rnapii）启动子、基因特异性sgRNA原间隔区、sgRNA支架和rnapii终止子组成。然而，gBlock DNA序列通常较长且重复性强，使得人工合成DNA的设计成本高昂，且采用传统的组装方法非常费力（Gao等人，2016；Peterson等人，2016；Zhang等人，2016；Char等人，2017；Durr等人，2018；Pauwels等人，2018；Schuster，2018；Wu等人，2018；Hui等人，2019；Fonseca等人，2020）。例如，Durr等人。（2018）开发了一种双sgRNA载体，首先修改一个pEN嵌合体进入载体，生成两个gBlocks，然后分别通过限制性酶将两个GRNA插入修改后的入口载体中，最后将两个gBlocks克隆到二元载体中。所需的多个步骤既费时又费力。尽管有报道称，通过引入重复性gBlocks进行靶向基因组编辑来实现CRISPR/Cas9平台的多元化（Ordon等人，2016；Schuster，2018），但一些研究指出，高重复性DNA序列的转化可触发多种物种中RNA表达盒的重组和沉默（Ma和Mitra，2002年；Lovett等人，2004年；Brake等人，2008年）。为了简化拟南芥的靶向基因组区域和最小化潜在的重组，我们结合和修改了现有的克隆组装步骤。首先，我们从先前开发的向量pHEE2E-TRI（Wang等人，2015年）中扩增出目标特定的两个gBlocks的中间边界。其次，我们将中间边界克隆到一个已知的CRISPR/Cas9二进制向量pKIR1.1（Maruyama等人，2013；Tsutsui and Higashiyama，2017），允许两个具有不同Poll-III依赖性启动子的gBlocks减少重复性。该载体含有一个RPS5A-Cas9盒，在包括卵细胞在内的所有发育阶段驱动Cas9蛋白的高结构表达，从而实现拟南芥T1代的高效突变。此外，该系统中的表达盒OLE1-tagRFP在种子中显示红色荧光，可以快速筛选初级转化子种子中可遗传的不含Cas9的拟南芥突变体。我们将这两种载体的优点通过一次PCR和一次克隆步骤结合起来，从而为获得稳定的遗传缺失突变体提供了一种简单可靠的方法。我们的策略可以节省在拟南芥中删除任何染色体区域的成本和时间，并且很可能适用于同时编辑多个基因的基因组。它也有可能简化其他植物物种的基因组缺失。
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