Ceratocystis fimbriata f. sp. platani
2003; Wiley; Volume: 33; Issue: 2 Linguagem: Catalão
10.1046/j.1365-2338.2003.00640.x
ISSN1365-2338
Autores Tópico(s)Plant Pathogens and Fungal Diseases
ResumoEPPO BulletinVolume 33, Issue 2 p. 249-255 Free Access Ceratocystis fimbriata f. sp. platani First published: 29 October 2003 https://doi.org/10.1046/j.1365-2338.2003.00640.xCitations: 5 European and Mediterranean Plant Protection OrganizationPM 7/14(1) Organisation Européenne et Méditerranéenne pour la Protection des Plantes AboutSectionsPDF ToolsRequest permissionExport citationAdd to favoritesTrack citation ShareShare Give accessShare full text accessShare full-text accessPlease review our Terms and Conditions of Use and check box below to share full-text version of article.I have read and accept the Wiley Online Library Terms and Conditions of UseShareable LinkUse the link below to share a full-text version of this article with your friends and colleagues. Learn more.Copy URL Share a linkShare onFacebookTwitterLinkedInRedditWechat Specific scope This standard describes a diagnostic protocol for Ceratocystis fimbriata f. sp. platani. Champ d'application spécifique Cette norme décrit un protocole de diagnostic pour Ceratocystis fimbriata f. sp. platani. Specific approval and amendment First approved in 2002-09. Approbation et amendement spécifiques Première approbation en 2002-09. Introduction Ceratocystis fimbriata f. sp. platani causes a destructive tracheomycosis in Platanus spp., particularly in the EPPO region Platanus×hispanica, with infected trees dying within 3–7 years (EPPO/CABI, 1997). The disease is present in the USA, Armenia, Italy, France and Switzerland. The fungus is transmitted by contaminated pruning tools and terracing machinery which causes damage to the roots. It may be transmitted also by root contact (anastomosis), and from infected dead plant tissue which may be present for up to 5 years in soil. Sawdust and wood chips from diseased trees are highly infective. Apart from phytosanitary measures which prevent the spread of the disease to new areas, no control method is available. Introduction Ceratocystis fimbriata f. sp. platani est l'agent d'une trachéomycose destructrice des platanes (Platanus spp.), et notamment dans la région OEPP de Platanus×hispanica. Les arbres infectés meurent en trois à sept ans (EPPO/CABI, 1997). La maladie est présente aux Etats-Unis, en Arménie, en Italie, en France et en Suisse. Le champignon est transmis par les outils de taille contaminés et les machines de terrassement qui endommagent les racines. Il peut aussi être transmis par contacts racinaires (anastomose), et à partir de tissus végétaux infectés morts qui peuvent persister pendant 5 ans dans le sol. La sciure et les copeaux de bois provenant des arbres malades sont très infectieux. Mis à part les mesures phytosanitaires visant à empêcher la dissémination de la maladie vers de nouvelles zones, aucune méthode de lutte n'est disponible. Identity Name: Ceratocystis fimbriata Ellis & Halsted f. sp. platani Walter Synonyms: Endoconidiophora fimbriata (Ellis & Halsted) Davidson f. sp. platani Walter Anamorph: Chalara sp. Taxonomic position: Fungi; Ascomycota; Ophiostomatales Bayer computer code: CERAFP Phytosanitary categorization: EPPO A2 list no. 136; EC Annex designation II/A2 Identité Nom: Ceratocystis fimbriata Ellis & Halsted f. sp. platani Walter Synonymes: Endoconidiophora fimbriata (Ellis & Halsted) Davidson f. sp. platani Walter Anamorphe: Chalara sp. Classement taxonomique: Fungi; Ascomycota; Ophiostomatales Code informatique Bayer: CERAFP Catégorisation phytosanitaire: liste A2 de l'OEPP no. 136; Désignation Annexes UE II/A2 Detection Platanus spp. are the only hosts of this forma specialis. The pathogen can be present in growing plants, wood, wood chips and sawdust. Plants may be affected singly or in groups. A single branch with sparse chlorotic foliage is usually seen first. On the side bearing this branch, the bark becomes necrotic, pale brown and cracked, and adheres to the tree. The edges of the lesions show no wood callus formation, but extend as bluish-black filaments or veins which are more evident when the bark is peeled off (Fig. 1). On the surface of timber and in chips, the only detectable symptom is a dark colour. Figure 1Open in figure viewerPowerPoint Typical discoloration areas of a cut trunk of Platanus infected by Ceratocystis fimbriata f. sp. platani/Zones de décoloration caractéristique d'une section de tronc de platane infecté par Ceratocystis fimbriata f. sp. platani. Detection when the host is alive C. f. platani can be detected in samples collected on the edge of lesions by means of an increment borer. Thin hand-made sections are then directly prepared from cores, and the presence of the fungus can be ascertained by light microscope observation of dark diagnostic chlamydospores inside xylem vessels (200–400×) (Fig. 2). Figure 2Open in figure viewerPowerPoint Presence of chlamydospores of Ceratocystis fimbriata f. sp. platani inside xylem vessels/ Présence de chlamydospores de Ceratocystis fimbriata f. sp. platani dans les vaisseaux du xylème. In the absence of chlamydospores, the following methods are used for detection and positive identification of the pathogen: • cores collected on the edge of lesions by means of an increment borer are cut into discs (2–3 mm thick), rapidly flamed and incubated in a moist chamber at 20–25 °C. C. fimbriata, if present, produces endoconidia after 3–8 days (Vigouroux, 1979); • the pathogen can be isolated from pieces of wood taken from the edge of a lesion on a freshly diseased plant. These are rapidly flamed and incubated on potato dextrose agar (PDA, Oxoid) or malt agar (Oxoid, 20 g L−1) at 20–25 °C for 3–6 days. Detection when the host is dead From dead material, successful isolation on agar media is highly unlikely, as many saprophytic fungi colonize dead wood. To detect C. f. platani in wood samples or soil, a trap technique has been described by Grosclaude et al. (1988). A small healthy branch of Platanus sp. is stripped of its bark and placed in a sterile beaker (so that two-thirds of the branch is immersed) containing continuously aerated water and the wood or soil sample. After 1–3 weeks of incubation at room temperature, the fungus develops on the emergent portion of the branch. Détection Les platanes sont les seuls hôtes de cette forma specialis. Le pathogène peut être présent dans les plantes en croissance, les grumes, les copeaux et la sciure. Les plantes peuvent être attaquées individuellement ou en groupe. On observe d'abord en général une seule branche portant un feuillage chlorotique clairsemé. Sur le côté de l'arbre portant cette branche, l'écorce devient nécrotique, brun pâle, fissurée et adhère à l'arbre. Les bords des lésions ne montrent pas de formation de cal, mais s'étendent sous forme de filaments bleu-noir ou de nervures qui sont plus clairement visibles lorsque l'écorce est enlevée (Fig. 1). A la surface du bois et dans les copeaux, le seul symptôme observable est une couleur sombre. Détection lorsque l'hôte est vivant C. f. platani peut être détecté dans des échantillons collectés en bordure des lésions au moyen d'une tarière. De fines sections sont ensuite préparées manuellement à partir des carottes et la présence du champignon est confirmée par observation au microscope de chlamydospores dans les vaisseaux du xylème (200–400×) (Fig. 2). En l'absence de chlamydospores, les méthodes suivantes de détection et d'identification positive du pathogène sont requises: • des carottes, prélevées en bordure des lésions au moyen d'une tarière sont débitées en disques (2–3 mm d'épaisseur), rapidement passées à la flamme et incubées dans une chambre humide à 20–25 °C. Si C. fimbriata est présent, il produit des endoconidies après 3–8 jours (Vigouroux, 1979); • le pathogène peut être isoléà partir de morceaux de bois prélevés en bordure des lésions sur une plante nouvellement malade. Ces morceaux de bois sont rapidement passés à la flamme et incubés sur de la gélose de pomme de terre-dextrose (PDA, Oxoid) ou de la gélose de malt (Oxoid 20 g L−1) à 20–25 °C pendant 3–6 jours. Détection lorsque l'hôte est mort Sur du matériel mort, la réussite de l'isolement sur milieu gélosé est très improbable, car de nombreux champignons saprophytes colonisent le bois mort. Pour détecter C. f. platani dans des échantillons de bois ou dans le sol, une technique de piégeage a été décrite par Grosclaude et al. (1988). Une petite branche saine de platane est écorcée et placée dans un bécher stérile (de manière à ce que les deux-tiers de la branche soient immergés) contenant de l'eau continuellement aérée et l'échantillon de bois ou de sol. Après 1–3 semaines d'incubation à température ambiante, le champignon se développe sur la partie non immergée de la branche. Identification Growth characteristics in culture Growth rate is 0.3–0.5 cm day−1 on average on PDA at 24 °C. The mycelium is at first hyaline and more or less dense. The colonies are thicker on PDA than on malt agar. Later, the colonies can produce three kinds of conidia and, very often, perithecia. With age, the colonies become brownish-green on the underside because of the presence of chlamydospores, and are grey-whitish on the surface due to the presence of hyaline endoconidia, with dark spots due to perithecia. Each isolate takes a different time for the production of conidia and perithecia. Morphology Conidia of the first kind are generally produced within 5 days. They are hyaline, truncate, cylindrical endoconidia (5–40 × 3–6 µm). More rarely, light brown doliform endoconidia (7–12 × 6–9 µm) are formed in short chains. The asexual spores of the third type produced by the fungus are thick-walled chlamydospores which are bulbous and brownish-green (11–19 × 9–15 µm). These are very numerous in infected wood and can be useful for direct diagnosis. When perithecia (approx. 200 µm) are produced, they have a very long neck (400–800 µm) but some strains produce no perithecia and others produce only aborted ones. The ascospores are characteristically shaped like bowler hats (4–8 µm) (see Fig. 3b). Figure 3Open in figure viewerPowerPoint Ceratocystis fimbriata f. sp. platani. (a) perithecium/périthèce; (b) ascospores; (c) conidia/conidies; (d) chlamydospores. Original drawings by G. Di Giambattista (Istituto Sperimentale per la Patologia Vegetale, Via C.G. Bertero 22, I-00156 Rome, Italy). Identification Caractéristiques de croissance en culture Le taux de croissance est de 0,3–0,5 cm par jour en moyenne sur PDA à 24 °C. Le mycélium est dans un premier temps hyalin et plus ou moins dense. Les colonies sont plus épaisses sur gélose de pomme de terre-dextrose que sur gélose de malt. Par la suite, les colonies produisent trois sortes de conidies et, très souvent, des périthèces. En vieillissant, les colonies deviennent vert-brunâtre à leur face inférieure en raison de la présence de chlamydospores, et sont gris-blanchâtre en surface à cause de la présence d'endoconidies hyalines, avec des taches noires dues aux périthèces. Le temps nécessaire à la production de conidies et de périthèces varie selon les isolats. Morphologie Le premier type de conidies est généralement produit en 5 jours. Il s'agit d'endoconidies hyalines, tronquées et cylindriques (5–40 × 3–6 µm). Plus rarement, des endoconidies doliformes brun pâle (7–12 × 6–9 µm) sont formées en chaines courtes. Le champignon produit un troisième type de spores asexuées, sous forme de chlamydospores à parois épaisses, bulbeuses et vert brunâtre (11–19 × 9–15 µm), qui sont très nombreuses dans le bois infecté et peuvent être utiles pour le diagnostic direct. Lorsque les périthèces (environ 200 µm) sont produits, ils ont un col très long (400–800 µm) mais certaines souches ne produisent pas de périthèces et d'autres produisent seulement des périthèces avortés. Les ascospores ont une forme caractéristique de chapeau-melon (4–8 µm). Comparison with similar species Other species have similar anamorphs (e.g. Ceratocystis paradoxa, Ceratocystis moniliformis), but none has been reported on Platanus. The morphological diagnostic characteristics are: • C. f. platani produces perithecia on which appendages are absent (Fig. 3), unlike the similar species (C. paradoxaFig. 4 and C. moniliformisFig. 5). • C. paradoxa produces very abundant dark conidia that confer a black powdery appearance to the colonies. Growth is rapid (more than 1 cm day−1 on PDA at 24 °C). • C. moniliformis does not produce chlamydospores. Figure 4Open in figure viewerPowerPoint Ceratocystis moniliformis. (a) perithecium/périthèce; (b) perithecial appendages appendices du périthèce (schematic/schématique). Redrawn from Luc (1952). Figure 5Open in figure viewerPowerPoint Ceratocystis paradoxa. (a) perithecium/périthèce; (b) perithecial appendages/appendices du périthèce. Redrawn from Dade (1928). Any doubt about the identification can be resolved by testing fungal mycelium by a PCR-based RFLP method (see Appendix I). Comparaison avec des espèces similaires D'autres espèces ont des anamoprhes similaires (par ex. Ceratocystis paradoxa, Ceratocystis moniliformis), mais ils ne sont pas signalés sur platane. Les caractéristiques morphologiques du diagnostic sont: • C. f. platani produit des périthèces sans appendices (Fig. 3), contrairement aux espèces similaires (C. paradoxaFig. 4 et C. moniliformisFig. 5). • C. paradoxa produit des conidies sombres très abondantes qui donnent une apparence poudreuse noire aux colonies. La croissance est rapide (plus d'1 cm par jour sur PDA à 24 °C). • C. moniliformis ne produit pas de chlamydospores. Les doutes relatifs à l'identification peuvent être résolus en testant le mycélium par une méthode de polymorphisme de longueur de fragments de restriction (RFLP) après PCR (voir Annexe I). Reference cultures ATCC (1984) no. 38160 (from Platanus orientalis), S. Accordi Mutto, Istituto Patologia Vegetale – Università degli Studi di Padova, Agripolis, Legnaro, I-35020 (IT) no. 44186 (from Platanus×hispanica), A. Vigouroux, INRA, Unité de Formation et de Recherche de Biologie et Pathologie Végétales, 34060 Montpellier (FR). Istituto Sperimentale per la Patologia Vegetale, 22 Via C.G. Bertero, I-00145 Roma (IT) has a collection of about 20 Italian isolates. Cultures de référence ATCC (1984) – n. 38160 (de Platanus orientalis), S. Accordi Mutto, Istituto Patologia Vegetale – Università degli Studi di Padova, Agripolis, Legnaro, I-35020 (IT) n. 44186 (de P.×hispanica), A. Vigouroux, INRA, Unité de Formation et de Recherche de Biologie et Pathologie Végétales, 34060 Montpellier (FR). L'Istituto Sperimentale per la Patologia Vegetale, 22 Via C.G. Bertero, I-00145 Roma (IT) possède une collection d'environ 20 isolats italiens. Requirements for positive identification The procedures for detection and identification described in this protocol should have been followed. Microscopic examination of sections from live wood should show chlamydospores. If no chlamydospores are found, then discs incubated for 3–8 days at 20–25 °C should show typical endoconidia; or a culture produced on PDA should show the correct growth characteristics and morphology (as described in this protocol). If there is any doubt about the culture characteristics, then a PCR-RFLP (as described in this protocol) can distinguish Ceratocystis spp. from other fungi, and C. fimbriata f. sp. platani from other species. Samples from dead wood or soil should cause fungal growth on a branch of Platanus in the trap technique described in this protocol, and the fungus should then be isolated and positively identified as above. Exigences pour une identification positive Les procédures de détection et d'identification décrites dans ce protocole doivent avoir été suivies. L'examen au microscope de sections de bois vivant doivent mettre en évidence des chlamydospores. Dans le cas contraire, des disques incubés pendant 3–8 jours à 20–25 °C doivent présenter des endoconidies caractéristiques, ou une culture produite sur PDA doit présenter les caractéristiques de croissance et morphologiques correctes (décrites dans ce protocole). Si des doutes subsistent sur les caractéristiques de la culture, une méthode de PCR-RFLP (comme décrite dans ce protocole) peut permettre de distinguer Ceratocystis spp. des autres champignons, et C. f. platani des autres espèces. Les échantillons de bois mort ou de sol doivent avoir entraîné la croissance du champignon sur une branche de platane par la technique de piégeage décrite dans ce protocole, et le champigon doit ensuite être cultivé et identifié comme ci-dessus. Report on the diagnosis A report on the execution of the protocol should include: • information on the origin of the infected material; • a description of the disease symptoms (including if possible photographs); • measurements and drawings or photographs (as relevant) of the morphological features; • an indication of the magnitude of the infection (how much damaged tissue); • comments on the certainty or uncertainty of the identification. Storage of the pathogen isolate in culture may also be required. The pathogen can be maintained on an agar slant (PDA, malt agar) at 5–6 °C. Periodical inoculation (12–18 months) on detached host material and reisolation will prevent alterations of morphological and physiological characteristics. Rapport sur le diagnostic Le rapport sur la mise en oeuvre du protocole doit comporter: • des informations sur l'origine du matériel infecté; • une description des symptômes de maladie (de préférence avec des photographies); • des mesures ou des dessins ou photographies (le cas échéant) des caractères morphologiques; • une indication de l'étendue de l'infection (quantité de tissus endommagés); • des commentaires sur les certitudes ou les doutes liés à l'identification. La conservation du pathogène en culture peut aussi être demandée. Le pathogène peut être maintenu sur gélose inclinée (de PDA ou de malt) à 5–6 °C. Une inoculation périodique (12–18 mois) sur du matériel hôte détaché et le ré-isolement empêchent les altérations des caractères morphologiques et physiologiques. Further information/Renseignements supplémentaires Further information on this organism can be obtained from:/Des renseignements supplémentaires sur cet organisme peuvent être obtenus auprès de: T. Annesi, E. Motta & M. Pilotti – Istituto Sperimentale per la Patologia Vegetale, Via C.G. Bertero 22, 00145 Roma (IT). S. Accordi Mutto – Dipartimento Territorio e Sistemi Agro-Forestali – Sezione di Patologia Vegetale, Università degli Studi di Padova, Strada Romea 16, 35020 Legnano (IT). A. Panconesi – CNR, Istituto per la Patologia degli Alberi Forestali, Piazzale delle Cascine 28, 50144 Firenze (IT). A. Vigouroux – Laboratoire de Biologie et Pathologie Végétale, INRA, Unité de Formation et de Recherche de Biologie et Pathologie Végétales, 34060 Montpellier (FR). Acknowledgements/Remerciements This protocol was originally drafted by:/Ce protocole a été initialement préparé par: T. Annesi, E. Motta & M. Pilotti, Istituto Sperimentale per la Patologia Vegetale, 22 Via C.G. Bertero, 00145 Rome (IT). Appendices Appendix I Procedure for identification of Ceratocystis fimbriata f. sp. platani by PCR assay Specific primers are available for the identification of the genus Ceratocystis by polymerase chain reaction (PCR). Distinguishing C. f. platani from the other Ceratocystis spp. is then possible by performing restriction fragment length polymorphisms (RFLP) after PCR. The following protocol is adapted from the paper by Witthuhn et al. (1999) for a PCR-based RFLP identification method. See the paper of Witthuhn et al. (1998) for PCR conditions and that of Harrington & Wingfield (1995) for preparation of crude template. Genus-specific ITS-PCR Preparation of the sample 1 Inoculate MYEA plates (2% malt extract, 0.2% yeast extract, 1.5% agar) with the fungal isolates to be tested and incubate at room temperature (approximately 20 °C) to obtain actively growing cultures. Preparation of template DNA 2 Perform PCR amplification directly from fungal mycelium, as follows: scrape a pipette tip approximately 1 cm across the actively growing mycelium at the edge of the colony. Dip the tip of the pipette into the PCR tube containing the reaction mixture and mineral oil, then stir the mixture vigorously with the tip. This is done in order adequately to suspend the fungal material attached to the tip in the reaction mixture. Controls should also be set up, including mycelium from a known culture of C. f. platani (positive control) and a PCR tube containing the reaction mixture without any template (negative control). PCR amplification 3 Prepare a standard volume of the PCR mixture (50 µL for each PCR tube) for each test sample according to the following indications: Taq polymerase2.5 units 10× PCR buffer5 µL MgCl26.25 mm dNTPs250 µm Primer ITS1: 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′0.5 µm Primer LR6: 5′-CGCCAGTTCTGCTTACC-3′0.5 µm Add sterile distilled water to make total volume to 50 µL. Overlay each master mix with sterile mineral oil, if a thermocycler without heated lid is to be used. 4 Programme a thermocycler as follows, and insert the reaction mixture: (i) denaturation for 60 s at 96 °C; (ii) 35 cycles of primer annealing for 30 s at 55 °C, elongation for 60 s at 72 °C, denaturation for 60 s at 92 °C; (iii) elongation for 5 min at 72 °C. Detection of Ceratocystis spp. amplicons by agarose gel electrophoresis 5 Prepare a 1.5% agarose gel made with 0.5× TBE standard buffer (4.5 mm Tris, 4.5 mm boric acid and 1 mm EDTA pH 8). 6 On a sheet of parafilm, mix 10 µL of the PCR sample with 2 µL loading buffer (0.25% bromophenol blue, 0.25% xylene cyanol FF in 30% glycerol in distilled water) at the rate of 5:1. 7 Load separately, in the wells of the gel, the samples and a DNA molecular-weight marker suitable for the migration of 1600-bp DNA fragments (to be detected in case of Ceratocystis spp. amplification products). 8 Perform electrophoresis at 80 V in 0.5× TBE buffer and stop the run after the time necessary for correct evaluation of the molecular weight of amplification products appreciated as single bands. 9 Stain the gel for 30 min in an aqueous solutions of ethidium bromide at 0.5 µg mL−1. Place the gel in a tank of fresh distilled water to remove excess ethidium bromide that could create high background fluorescence. 10 Visualize the amplification products using UV light (312 nm). Sampled fungi which are Ceratocystis spp. produce 1.6-kb amplicons. Identification of Ceratocystis fimbriata f. sp. platani by ITS-RFLP In order to distinguish C. f. platani from other Ceratocystis spp., digest amplification products separately with the restriction enzymes AluI and DraI according to the manufacturer's instructions. These enzymes have a working temperature of 37 °C. Analyse the restriction pattern in 2% agarose gel made with 0.5× TBE buffer (as previously described). Determine the size of the restriction products against a 50–2000 bp DNA molecular weight marker. Digestion with AluI of the C. f. platani amplicon produces a restriction pattern that is different from most Ceratocystis spp., including C. fimbriata isolates of Populus and Prunus spp.; this pattern is composed of fragments of the following size: 150, 180, 220 + 720 bp. However, C. albofundus (host: Acacia mearnsii) shows the same AluI restriction pattern. Distinction can be made between C. albofundus and C. f. platani by treatment with DraI, as the amplification product of C. albofundus is cut into three fragments (150, 320 + 1200 bp) and that of C. f. platani is left uncut. Annexe I Procédure d'identification de Ceratocystis fimbriata f. sp. platani par PCR Des amorces spécifiques sont disponibles pour l'identification du genre Ceratocystis par PCR. Distinguer C. f. platani des autres Ceratocystis spp. est alors possible en effectuant une RFLP après PCR. Le protocole suivant est adapté de l'article de Witthuhn et al. (1998) sur une méthode d'identification par RFLP après PCR; voir l'article de Witthuhn et al. (1998) pour les conditions de la PCR et celui de Harrington & Wingfield (1995) pour la préparation de l'ADN cible. ITS-PCR spécifique au genre Préparation de l'échantillon 1 Inoculer des boites MYEA (extrait de malt 2%, extrait de levure 0,2%, gélose 1,5%) avec les isolats du champignon à-tester et incuber à température ambiante (environ 20 °C) pour obtenir des culture à croissance active. Préparation de l'ADN cible 2 L'amplification par PCR est réalisée directement à partir du mycélium fongique, comme suit: gratter le mycélium en croissance active du bord de la colonie sur environ 1 cm avec l'extrémité d'une pipette. Tremper l'extrémité de la pipette dans un tube de PCR contenant le mélange de réaction et de l'huile minérale, puis mélanger vigoureusement, pour mettre en suspension le matériel adhérant à l'extrémité de la pipette. Des témoins, y compris du mycélium d'une culture connue de C. f. platani (témoin positif) et un tube de PCR contenant un mélange réactionnel sans ADN cible (témoin négatif) doivent également être préparés. Amplification 3 Préparer un volume standard de mélange réactionnel de PCR (50 µL pour chaque tube de PCR) pour chaque échantillon à-tester, selon les indications suivantes: Polymérase Taq2,5 unités Tampon de PCR 10×5 µL MgCl26,25 mm dNTPs250 µm Amorce ITS1: 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′ 0,5 µm Amorce LR6: 5′-CGCCAGTTCTGCTTACC-3′0,5 µm Compléter à 50 µL avec de l'eau distillée stérile. Recouvrir chaque mélange de base avec de l'huile minérale stérile si le thermocycleur n'est pas pourvu de couvercle chauffant. 4 Paramétrer le thermocycleur selon le programme suivant et y placer les échantillons: (i) dénaturation pendant 60 s à 96 °C; (ii) 35 cycles de 30 s à 55 °C, 60 s à 72 °C et 60 s à 92 °C; (iii) élongation pendant 5 min à 72 °C. Détection des amplicons de Ceratocystis spp. par électrophorèse sur gel d'agarose 5 Préparer un gel d'agarose à 1,5% avec un tampon standard TBE 0,5× (4,5 mm Tris, 4,5 mm d'acide borique et 1 mm EDTA pH 8). 6 Sur une feuille de parafilm, mélanger 10 µL de l'échantillon de PCR avec 2 µL de tampon de charge (0,25% de bleu de bromophénol, 0,25% de xylène cyanol FF dans du glycérol à 30% dans de l'eau distillée) en proportion de 5:1. 7 Charger séparément dans les puits le gel, les échantillons et un marqueur de poids moléculaire adéquat pour évaluer la migration de fragments d'ADN de 1600 pb (devant être détectés dans le cas des produits d'amplification de Ceratocystis spp.). 8 Effectuer l'électrophorèse à 80 V dans du tampon TBE 0,5× et arrêter après le temps nécessaire pour évaluer correctement le poids moléculaire des produits d'amplification qui doivent être apparaître sous forme de bandes individuelles. 9 Colorer le gel pendant 30 min dans une solution aqueuse de bromure d'éthidium à 0,5 µg mL−1. Placer le gel dans un récipient d'eau distillée fraîche pour éliminer l'excès de bromure d'éthidium pouvant créer une fluorescence d'arrière plan forte. 10 Visualiser les produits d'amplification sous lumière UV (312 nm). Les champignons échantillonnés appartenant àCeratocystis spp. produisent des amplicons de 1,6 kb. Identification de Ceratocystis fimbriata f. sp. platani par ITS-RFLP Pour distinguer C. f. platani des autres Ceratocystis spp., digérer les produits d'amplification séparément avec les enzymes de restriction AluI et DraI conformément aux instructions du fabricant. Ces enzymes fonctionnent à 37 °C. Faire migrer les produits de la digestion enzymatique dans un gel d'agarose à 2% dans du tampon TBE 0,5× (comme décrit précédemment). Après coloration et révélation, évaluer la taille des produits de restriction par rapport à un marqueur moléculaire d'ADN de 50–2000 pb. La digestion avec AluI de l'amplicon de C. f. platani produit des fragments de restriction différents de ceux de la plupart des Ceratocystis spp., y compris des isolats de C. fimbriata sur Populus et Prunus spp.; il s'agit de fragments de taille 150, 180, 220 + 720 pb. En revanche, C. albofundus (hôte: Acacia mearnsii) présente les mêmes caractéristiques avec AluI. Une distinction peut être faite entre C. albofundus et C. f. platani par un traitement avec DraI, car le produit d'amplification de C. albofundus est coupé en trois fragments (150, 320 + 1200 bp) tandis que celui de C. f. platani n'est pas fragmenté. References/Références Dade HA (1928) Ceratostomella paradoxa, the perfect stage of Thielaviopsis paradoxa. Transactions of the British Mycological Society 13, 184– 194. EPPO/CABI (1997) Ceratocystis fimbriata f. sp. platani. In: Quarantine Pests for Europe, 2nd edn, pp. 674– 677. CAB International, Wallingford (GB). Grosclaude C, Olivier R, Pizzuto J-C, Romiti C & Madec S (1988) Détection par piégeage du Ceratocystis fimbriata f. platani. Application a l'étude de la persistance du parasite dans du bois infecté. European Journal of Forest Pathology 18, 385– 390. Harrington TC & Wingfield BD (1995) A PCR-based identification method for species of Armillaria. Mycologia 87, 280– 288. Luc M (1952) Ophiostoma moniliforme et ses diverses formes. Revue de Mycologie 17 (Suppl. 1), 10– 16. Vigouroux A (1979) Une méthode simple de recherche de Ceratocystis fimbriata f. platani sur arbre en place. European Journal of Forest Pathology 9, 316– 320. Witthuhn KC, Wingfield BD, Wingfield MJ & Harrington TC (1999) PCR-based identification and phylogeny of species of Ceratocystis fimbriata sensu strictu. Mycological Research 103, 743– 749. Witthuhn RC, Wingfield BD, Wingfield MJ & Wolfaardt M (1998) Monophyly of the species in the Ceratocystis coerulescens complex based on DNA sequence data. Mycologia 90, 96– 101. Citing Literature Volume33, Issue2August 2003Pages 249-255 FiguresReferencesRelatedInformation
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